嗜热菌的耐热机制探析

由于嗜热菌的最低生长温度为45℃左右，最适生长温度为50～60℃，最高生长温度为70℃或70℃以上。因此根据这个温度界定，嗜热菌主要存在于蓝绿藻、原始细菌、放线菌、厌氧光合细菌、硫细菌、海藻、真菌、芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属、乳酸菌和其他属中。在食品中最重要的嗜热菌主要存在于芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属和嗜热厌氧菌属中。

嗜热菌生长过程中，生长迟缓期很短，有时甚至难以测出，而其孢子的萌发及生长较迅速，对数生长期持续时间很短，在高温时某些嗜热菌的生长代时只有10 min。嗜热菌的死亡速率也很高，通常低于嗜热菌生长温度范围会失活。

嗜热菌能在较高温度中生长，其原因与食品保藏方面有关，但更与嗜热菌的生物学特性有着密切联系。

1.嗜热菌的细胞膜组分

嗜热菌细胞膜的磷脂双分子层中具有很多结构特殊的复合类脂，主要是甘油脂肪酰二酯。随着温度的升高，复合类脂中烷基链彼此间隔扩大，而极性部分作为膜的双层结构则保持整齐状态——液晶态。嗜热菌的细胞膜通常通过调节磷脂组分而维持膜的液晶态，以获得更高的熔点。嗜热菌的细胞膜中含有异型脂肪酸、稳定型脂肪酸和环烷型脂肪酸，而无不稳定的不饱和脂肪酸。增加磷脂酰烷基链的长度，增加异构化支链的比率，或增加脂肪酸饱和度都可维持膜的液晶态，从而使嗜热菌的细胞膜耐受高温。

2.嗜热菌蛋白质和嗜热酶

决定嗜热菌耐热性的主要机制是蛋白质的热稳定性，在80℃以上环境中能发挥功能的酶称为嗜热酶。嗜热酶对不可逆的变性有抗性，并且在高温下（60～120℃）具有最佳活性，有的酶甚至在超过140℃时也能稳定1 h以上，嗜热酶在工业生产中有很大的利用价值。

嗜热菌分泌的酶可以分为以下3种类型：

①在作用温度下稳定的酶：例如苹果酸脱氢酶、三磷酸腺苷酶、焦磷酸酶、醛缩酶和一些肽酶。

②在作用温度下易失活的酶：这类酶因缺少某些特定的底物导致失活，例如天冬酰胺脱氨酶、过氧化氢酶、丙酮酸氧化酶、异柠檬酸裂合酶和一些膜结合酶等。

③高耐热性的酶和蛋白质：例如α-淀粉酶、一些蛋白酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、一些氨基酸活化酶、鞭毛蛋白质、酯酶和嗜热菌蛋白酶等。

一般来说，嗜热菌在高温环境下生长分泌产生的酶的耐热性比嗜温菌产生的酶较强，表6-15列举了嗜热菌和嗜温菌分泌的酶及其热稳定性。例如嗜热脂肪芽孢杆菌分泌产生的α-淀粉酶在70℃加热24 h仍然具有活性，在其最适pH 6.9时，该淀粉酶的最适作用温度为82℃，但这种酶需要Ca2+参与才能维持其热稳定性。

表6-15　嗜热菌和嗜温菌分泌的酶及其热稳定性比较

嗜热菌的蛋白质和嗜热酶高温环境中保持其稳定性的原因主要与以下几种因素有关。

（1）动态平衡学说。

有些学者认为嗜热菌的许多酶在高温下分解—合成的循环速度非常快，如果酶在循环的过程中具有活性，则微生物细胞内存在的酶就能保持一定的活性，即动态平衡学说。例如喜热嗜油芽孢杆菌（Bacillus thermoleovorans）中的儿茶酚2，3-双加氧酶是热不稳定的，但该菌能不断地分泌这种酶以维持较高的活性，从而维持了该菌的耐热性。(www.xing528.com)

（2）蛋白质的一级结构。

研究表明，蛋白质的一级结构中，若个别氨基酸的改变会引起离子键、氢键和疏水作用的变化，从而增加了蛋白质的热稳定性，这就是氨基酸的突变适应。研究表明，嗜热菌蛋白质中异亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸和精氨酸的含量均高于嗜温菌，而半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸的含量显著低于嗜温菌。这是因为脯氨酸的结构熵较小更易折叠，且一经折叠则需要很高的能量才能解开。因此，不影响蛋白质其他结构的前提下，脯氨酸的替代可以提高蛋白质的热稳定性；精氨酸和谷氨酸分别比带同样电荷的氨基酸有更大的侧链，侧链所提供的疏水作用及离子间相互作用能提高蛋白质的热稳定性。另外，嗜热酶基因在嗜温菌细胞中表达时，通常会保留酶的耐热性，这说明嗜热菌的耐热性具有遗传性。

（3）蛋白质天然构象的热稳定性。

与嗜温菌蛋白质相比，嗜热菌蛋白质的大小、亚基结构、螺旋程度、极性大小和活性中心等与其极为相似，但构成蛋白质高级结构的非共价力、结构域的包装、亚基与辅基的聚集以及糖基化作用、磷酸化作用等却不尽相同，通常蛋白对高温的适应决定于这些微妙的空间相互作用。但有同样活性中心的嗜热蛋白在常温下会由于过于“僵硬”而不能发挥作用。例如激烈火球菌（Pyrococcus furiosus）在118℃条件下稳定的红素氧还蛋白和铁氧还蛋白，其蛋白中的环状结构很小但α-螺旋很长，并且在氨基酸的氨基端和羧基端均有特殊的离子相互作用，而这些相互作用在温度升高时能阻止末端区域的解链。海栖热袍菌（Thermotoga maritima）中的3-磷酸甘油醛脱氢酶，证实大量极端嗜热菌的蛋白具有带电残基的盐键网络结构，该结构中辅酶的结合和结构域的偶联都能增加该菌的热稳定性。研究表明，温度耐受性与氢键和α-螺旋、β-折叠的数目无关，而与离子键（盐桥）有关，通常嗜热蛋白比嗜温蛋白约多14个盐桥即可获得热稳定性。

（4）其他促进酶热稳定性的因素。

化学修饰、多聚物吸附及酶分子内的交联也是提高蛋白质热稳定性的重要途径。嗜热蛋白酶离子结合位点上所结合的金属离子（如Ca2+、Mg2+、Zn2+等）可能起到类似于二硫键的桥连作用，促进其热稳定性的提高。

3.嗜热菌遗传物质热稳定性

（1）DNA的稳定性。

目前已知DNA双螺旋结构的稳定性是由配对碱基之间的氢键以及同一单链中相邻碱基的堆积力维持的。研究表明，芽孢杆菌属中嗜温菌和嗜热菌的DNA组成中，生长上限温度和（G+C）%之间存在正相关的关系，但是很多嗜热菌的（G+C）%与其对应的嗜温菌相差并不大，某些嗜热菌甚至比嗜温菌还要低。嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）DNA的（G+C）%高达60%～70%，其DNA的构型为A型的DNA-RNA杂合分子，A构型的DNA相邻碱基重叠偏差大，有利于维持较多的氢键。此外，组蛋白和核小体在高温下均有聚合成四聚体甚至八聚体的趋势，这也能保护裸露的DNA避免受到高温的降解。

（2）RNA的稳定性。

tRNA也是对热比较稳定的核酸分子。例如栖热菌属的tRNA的（G+C）%明显高于大肠埃希氏菌。最近发现极端嗜热菌tRNA的热稳定性与其转录后的修饰有关，修饰后的核苷酸有助于茎环上碱基之间的相互作用、D-环的堆积和新的氢键及离子对的产生。

4.核糖体

一般来说嗜热菌核糖体的热稳定性是其最高生长温度的决定性因子，见表6-16。目前已有报道耐热的核糖体，但不是DNA。例如在嗜热栖热菌HB8核糖体基因的插入灭活试验中，发现S17基因若被kat基因取代，会形成温度敏感突变型；若此时加入S17蛋白，则会恢复其嗜热性，这说明rRNA的热稳定性依赖于rRNA与核糖体之间的相互作用。此外，多胺在嗜热菌核糖体的稳定性上起着独特的作用，在嗜热脂肪芽孢杆菌的核糖体或rRNA中加入多胺（如腐胺）会提高耐热性。嗜热菌的转录遵循Szybalski规则，这导致了mRNA链上嘌呤碱基的富集。

表6-16　一些微生物的最高生长温度和核糖体的融点