测定食品中大肠菌群数的MPN方法及其意义

1.测定原理

大肠菌群（Coliforms）是指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。

食品中大肠菌群数是以每100mL（g）检样内大肠菌群的最可能数（Most Probable Number，简称MPN，是基于泊松分布的一种间接计数方法。）来表示的。据此含义，所有食品卫生标准中所规定的大肠菌群均应以100mL（g）食品内允许含有大肠菌群的实际数值为报告标准。检查大肠菌群数，一方面能表明食品中有无粪便污染，另一方面还可以根据数量的多少，判定食品受污染的程度。

2.培养基和试剂

1）月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤（见附录K）。

2）煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤（见附录K）。

3）结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）（见附录K）。

4）磷酸盐缓冲液（见附录K）。

5）无菌生理盐水（见附录K）。

6）无菌1mol/LNaOH（见附录K）。

7）无菌1mol/LHCl（见附录K）。

3.器具及其他用品

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

1）恒温培养箱：36℃±1℃。

2）冰箱：2～5℃。

3）恒温水浴箱：46℃±1℃。

4）天平：感量为0.1g。

5）均质器。

6）振荡器。

7）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。

8）无菌锥形瓶：容量500mL。

9）无菌培养皿：直径90mm。

10）pH计或pH比色管或精密pH试纸。

11）菌落计数器。

4.大肠菌群MPN计数法的检验程序(www.xing528.com)

大肠菌群MPN计数法的检验程序如图3-3所示。

5.操作步骤

（1）检样稀释

1）固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000～10000r/min均质1～2min，或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min，制成1∶10的样品匀液。

图3-3 大肠菌群MPN计数法的检验程序

2）液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1∶10的样品匀液。

3）样品匀液的pH值应为6.5～7.5，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。

4）用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。

5）根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。

（2）初发酵试验 每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（若接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），于36℃±1℃培养24h±2h，观察管内是否有气泡产生，对24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，未产气者为大肠菌群阴性。

（3）复发酵试验 用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，于36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。

（4）大肠菌群最可能数（MPN）的报告 根据确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录I），报告1g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。

6.大肠菌群平板计数法的检验程序（见图3-4）。

（1）样品的稀释 按操作步骤中“检样稀释”进行。

（2）平板计数

1）选取2～3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。

2）及时将15～20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3～4mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±1℃培养18～24h。

（3）平板菌落数的选择 选取菌落数在15～150CFU的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。

典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。

（4）证实试验 从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36℃±1℃培养24～48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。

图3-4 大肠菌群平板计数法的检验程序

（5）大肠菌群平板计数的报告 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以“平板菌落数的选择”中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例：10^-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×10⁴/g（mL）=6.0×10⁵ CFU/g（mL）。