如何测定食品中细菌总数？

1.测定原理

菌落总数是指食品检样经过处理并在一定条件下培养后，所得1mL（g）检样中形成菌落的总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可用以观察细菌在食品中繁殖的动态，细菌菌落总数的测定一般用国际标准规定的平板计数法，所得结果只包含一群能在营养琼脂上生长的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数，并不表示样品中实际存在的所有细菌的菌落总数。由于菌落总数并不能区分细菌的种类，故常被称为杂菌数或需氧菌数等。

食品中菌落总数越多，说明食品质量越差，病原菌污染的可能性越大；当菌落总数仅少量存在时，病原菌污染的可能性就会降低，或者几乎不存在。但不能单凭菌落总数一项指标来评定食品卫生质量的优劣，必须配合大肠菌群和病原菌项目的检验，才能对食品做出比较全面准确的评价。

2.材料

（1）培养基及试剂

1）平板计数琼脂培养基（见附录K）。

2）磷酸盐缓冲液（见附录K）。

3）无菌生理盐水（见附录K）。

（2）器具及其他用品

1）恒温培养箱：36℃±1℃，30℃±1℃。

2）冰箱：2～5℃。

3）恒温水浴箱：46℃±1℃。

4）天平：感量0.1g。

5）均质器。

6）振荡器。

7）无菌吸管：1mL（具有0.01mL刻度）与10mL（具有0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。

8）无菌锥形瓶：容量250mL、500mL。

9）无菌培养皿：直径90mm。

10）pH计或pH比色管或精密pH试纸。

11）放大镜或/和菌落计数器。

3.菌落总数的检验程序

菌落总数的检验程序如图3-2所示。

4.检样稀释及培养

1）固体和半固体样品称取25g样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000～10000r/min均质1～2min，或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min，制成1∶10的样品匀液。

2）液体样品以无菌吸管吸取25mL样品，置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1∶10的样品匀液。

3）用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注入盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。

4）重复以上操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。

图3-2 菌落总数的检验程序

5）根据对样品污染状况的估计，选择2～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液）。在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液放入无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内，作空白对照。

6）及时将15mL～20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

7）培养。待琼脂凝固后，将平板翻转，于36℃±1℃培养48h±2h（水产品于30℃±1℃培养72h±3h）。(www.xing528.com)

如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL），凝固后翻转平板，按上述条件进行培养。

5.菌落计数

可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（Colony-Forming Units，CFU）表示。

选取菌落数在30～300CFU、无蔓延菌落生长的平板计录菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数。大于300CFU的平板可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落数不到平板的1/2，而其余1/2中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，用于代表一个平板菌落数。

当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，可将每条单链作为一个菌落计数。

6.结果与报告

（1）菌落总数的计算方法

1）若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，则计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。

2）若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内，按式（3-9）计算：

N=∑C/（n₁+0.1n₂）d （3-9）

式中 N——样品中菌落数；

∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；

n₁——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；

n₂——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；

d——稀释因子（第一稀释度）。

示例：

上述数据按菌落总数的报告中2）修约后，表示为25000或2.5×10⁴。

3）若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

4）若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

5）若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

6）若所有稀释度的平板菌落数均不在30～300CFU，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

（2）菌落总数的报告

1）菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。

2）菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。

3）若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。

4）若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

5）称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。