如何测定还原糖质量分数？

1.直接滴定法

（1）测定原理 样品经除去蛋白质后，在加热条件下，直接滴定经标定的碱性酒石酸铜溶液，还原糖将二价铜还原为氧化亚铜。以亚甲基蓝为指示剂，在终点稍过量的还原糖将蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无色的还原型亚甲基蓝，根据试样所消耗的体积计算还原糖的含量。

直接滴定法已经过多次改进，只要严格遵守试验条件，分析结果的准确度和重现性是能够满足定量分析的要求。

（2）试剂

1）碱性酒石酸铜甲液：称取15g硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）及0.05g四甲基蓝，溶于水中并稀释至1000mL。

2）碱性酒石酸铜乙液：称取50g酒石酸钾钠及75g氢氧化钠，溶于水中，再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1000mL，贮存于橡胶塞玻璃瓶内。

3）乙酸锌溶液：称取乙酸锌结晶21.9g，加3mL冰醋酸，加水溶解至100mL。

4）106g/L亚铁氰化钾溶液：10.6g亚铁氰化钾，加水溶解至100mL。

5）葡萄糖标准溶液：准确称取1.0000g经过96℃±2℃干燥2h的纯葡萄糖，加水溶解后加入5mL盐酸，并以水稀释至1000mL。此溶液每1mL相当于1.0mg葡萄糖。

（3）操作方法

1）样品处理：准确称取样品（粉碎后的）2.5～5g并置于250mL容量瓶中，加水50mL，摇匀后慢慢加入5mL乙酸锌溶液，混匀后再慢慢加入5mL亚铁氰化钾溶液，振摇，加水定容并摇匀后静置30min，用干滤纸过滤，弃去初始滤液，过滤液备用。

2）标定碱性酒石酸铜溶液：吸取5.00mL碱性酒石酸铜甲液及5.00mL碱性酒石酸铜乙液，置于250mL锥形瓶中。加水10mL，加入玻璃珠3粒，从滴定管加约9mL标准葡萄糖液，使其在2min内加热至沸腾。趁沸腾以0.5滴/s的速度继续滴加糖液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录消耗葡萄糖液的体积。平行操作3次，得出平均消耗葡萄糖液的体积。

计算每10mL（甲、乙各5mL）碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量（mg），即

m=Vc （3-2）

式中 c——葡萄糖标准溶液的浓度（mg/mL）；

V——标定时消耗葡萄糖标准溶液的总体积（mL）；

m——10mL碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量（mg）。

3）样品溶液的预测定：吸取费林氏甲、乙液各5mL，置于150mL三角烧瓶中，加水10mL、玻璃珠2粒，控制在2min内加热至沸腾，趁沸腾以先快后慢的速度，从滴定管中滴加样液，趁沸腾以0.5滴/s的速度继续滴定至蓝色刚好褪去为终点，记录消耗样液的体积。

4）样品溶液的测定：吸取费林氏甲、乙液各5mL，置于150mL三角烧瓶中，加水10mL、玻璃珠2粒，从滴定管中加入比预测定体积少1mL的样液，使其在2min内加热至沸腾，趁沸腾以0.5滴/s的速度继续滴定至蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗的体积。同法平行操作3次，得出平均消耗样液的体积。

（4）结果计算

样品中还原糖质量分数的计算公式为

式中 w（还原糖）——还原糖的质量分数；

m——样品质量（g）；

V——测定时平均消耗样品溶液的体积（mL）；

m₁——10mL碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量（mg）；

250——样品溶液的总体积（mL）。

（5）说明及注意事项

1）乙酸锌及亚铁氰化钾作为蛋白质沉淀剂。

2）碱性酒石酸铜甲、乙液应分别配制，分别贮存，不能事先混合贮存。

3）测定中的滴定速度、加热时间及热源稳定程度、锥瓶壁厚度对测定精密度影响很大，在预测及正式测定过程中试验条件应力求一致。平行测定的样品溶液所消耗体积相差应不超过0.1mL。

4）整个滴定过程应保持在微沸状态下进行，继续滴至终点的体积应控制在0.5～1mL，否则应重做。

5）样品中还原糖的质量分数不宜过高及过低，需根据预测加以调节，以0.1%为宜。

6）滴定至终点，指示剂被还原糖所还原，蓝色消失，呈淡黄色，稍放置以便接触空气中的氧，指示剂被氧化就会重新变成蓝色，此时不应再滴定。

7）配制标准液的葡萄糖应先在50～60℃下干燥30min，然后置于98～100℃烘箱中烘至恒重。

8）碱性酒石酸铜的氧化能力较强，可将醛糖和酮糖都氧化，所以测得的是总还原糖的质量。

9）本法对糖进行定量的基础是碱性酒石酸铜溶液中Cu²⁺的量，所以，样品处理时不能采用硫酸铜-氢氧化钠作为澄清剂，以免样液中误入Cu²⁺，得出错误的结果。

10）在碱性酒石酸铜乙液中加入亚铁氰化钾，是为了使所生成的Cu₂O红色沉淀与之形成可溶性的无色络合物，使终点便于观察。

11）次甲基蓝也是一种氧化剂，但在测定条件下其氧化能力比Cu²⁺弱，故还原糖先与Cu²⁺反应，待Cu²⁺完全反应后，稍过量的还原糖才会与亚甲基蓝发生反应，溶液蓝色消失，指示到达终点。

2.高锰酸钾法(www.xing528.com)

该法是国家标准分析方法，它适用于各类食品中还原糖的测定，对于深色样液也同样适用。这种方法的主要特点是准确度高，重现性好，这两方面都优于直接滴定法。但操作复杂、费时，需查特制的高锰酸钾法糖类检索表（见附录D）。

（1）测定原理 将还原糖与过量的碱性酒石酸铜溶液反应，还原糖使二价铜还原为氧化亚铜。经过滤取得氧化亚铜，用硫酸铁溶液将其氧化溶解，而三价铁盐被还原为亚铁盐，再用高锰酸钾标准液滴定所产生的亚铁盐。根据高锰酸钾标准溶液的消耗量计算氧化亚铜的质量，从附录D中查得与氧化亚铜量相当的还原糖量，再计算样品中的还原糖含量。

（2）试剂

1）碱性酒石酸铜甲液：称取35.639g硫酸铜（CuSO₄·5H₂O），加适量水溶解，加0.5mL浓H₂SO₄，再加水稀释至500mL，用精制石棉过滤。

2）碱性酒石酸铜乙液：称取173g酒石酸钾钠与50g氢氧化钠，加适量水溶解，并稀释至500mL，用精制石棉过滤，贮存于橡胶塞玻璃瓶内。

3）精制石棉：先将石棉用3mol/L盐酸浸泡2～3h，用水洗净；再用100g/L氢氧化钠溶液浸泡2～3h，倾去溶液，之后用碱性酒石酸铜乙液浸泡数小时，用水洗净；再以3mol/L盐酸浸泡数小时，以水洗至不呈酸性。然后加水振摇，使其成微细的浆状软纤维，用水浸泡并贮存于玻璃瓶中，即可用作填充古氏坩埚用。

4）0.02mol/L高锰酸钾标准溶液：称取3.3g高锰酸钾溶于1050mL水中，缓缓煮沸20～30min，冷却后置于暗处密闭保存数日，用垂融漏斗过滤，保存于棕色瓶中。用基准草酸钠标定其准确浓度。

5）1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，加水溶解并稀释至100mL。

6）硫酸铁溶液：称取50g硫酸铁，加入200mL水溶解后，慢慢加入100mL硫酸，冷却后加水稀释至1000mL。

7）3mol/L盐酸：量取30mL浓盐酸，加水稀释至120mL。

（3）仪器

1）25mL古氏坩埚或G4垂融坩埚。

2）真空泵或水力真空管。

（4）测定方法

1）样品处理：

①乳及乳制品、含蛋白质的冷食类：称取2.5～5g固体样品（25～50mL液体样品）置于250mL容量瓶中，加50mL水，摇匀后加10mL碱性酒石酸铜甲液及4mL1mol/L氢氧化钠溶液至刻度，混匀，静置30min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，滤液供测定用。

②酒精性饮料：吸取100mL样品，置于蒸发皿中，用1mol/L氢氧化钠溶液中和至中性，蒸发至原体积的1/4后，移入250mL容量瓶中。加50mL水，混匀。以下按①项“加10mL碱性酒石酸铜甲液”起，依同样方法操作。

③含淀粉较多的食品：称取10～20g样品，置于250mL容量瓶中，加200mL水，在45℃水浴中加热1h，并时时振摇，冷却后加水至刻度，混匀，静置。吸取20mL上清液置于另一250mL容量瓶中。以下按①项“加10mL碱性酒石酸铜甲液”起，依同样方法操作。

④汽水等含二氧化碳的饮料：吸取100mL样品置于蒸发皿中，在水浴上除去CO₂后，移入250mL容量瓶中，并用水洗涤蒸发皿，洗液并入容量瓶中后，再加水至刻度，混匀后备用。

2）测定：吸取50mL处理后的样品溶液置于400mL烧杯内，加25mL碱性酒石酸铜甲液及25mL乙液，盖上表面皿，置电炉上加热，使在4min内沸腾，再准确沸腾2min，趁热用G4垂融坩埚或铺好石棉的古氏坩埚抽滤，并用60℃热水洗涤烧杯及沉淀，至洗液不呈碱性为止。将垂融坩埚或古氏坩埚放回400mL烧杯中，加25mL硫酸铁溶液及25mL水，用玻璃棒搅拌至氧化亚铜完全溶解，以0.02mol/L高锰酸钾标准液滴定至微红色为终点。同时吸取50mL水，加入与测样品时相同量的碱性酒石酸甲液、乙液、硫酸铁溶液及水，按同一方法做试剂空白试验。

（5）结果计算

1）根据滴定所消耗高锰酸钾标准溶液的体积，计算相当于样品中还原糖的氧化亚铜的质量，即

式中 m——氧化亚铜的质量（mg）；

V——测定用样品液所消耗高锰酸钾标准溶液的体积（mL）；

V₀——试剂空白试验消耗高锰酸钾的体积（mL）；

c——高锰酸钾标准溶液的浓度（mol/L）；

143.08——氧化亚铜的摩尔质量（mg/mmol）。

2）根据式（3-4）计算所得氧化亚铜的质量查附录D得出相当的还原糖的质量，再按式（3-5）计算样品中还原糖的含量，即

式中 w（还原糖）——还原糖的质量分数；

m₁——查表得出的相当还原糖的质量（mg）；

m——样品质量（g）；

V₁——样品处理液的总体积（mL）；

V₂——测定用样品处理溶液的体积（mL）。

（6）说明及注意事项

1）必须注意反应条件的控制，加入碱性酒石酸铜甲、乙液后必须控制在4min内煮沸，维持沸腾2min，时间要准确，否则会引起较大误差，重现性不好。

2）煮沸过程中若发现溶液蓝色消失，说明糖度过高，需减少样品处理液的用量，重新操作，而不应增加碱性酒石酸铜溶液的用量。

3）抽滤过程中应防止氧化亚铜沉淀暴露于空气中，需使沉淀始终在液面下避免氧化。

4）样品处理中利用硫酸铜在碱性条件下作为澄清剂，除去蛋白质等成分。