质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用

目前常用的微生物鉴定方法都是基于微生物的形态学、细胞生理生化,以及核酸基础建立的。自20世纪90年代,微生物鉴定系统不断发展,自动化程度不断提高,但仍然是建立在传统的生理生化和核酸基础上。近年来,基于蛋白质组学的质谱技术凭借其高灵敏度、高通量、快速等特点在微生物检测和鉴定方面得到快速发展。

1.质谱仪的原理及构造

质谱仪是利用电磁学原理,使带电的样品离子按质荷比进行分离的装置。其基本原理是使样品中的分析物在离子源中发生电离,生成不同质荷比的带电荷的离子,经加速电场的作用,形成离子束,进入质量分析器。质量分析器能够将同时进入其中的不同质量的离子,按质荷比m/z大小分离。分离后的离子依次进入离子检测器,采集放大离子信号,经计算器处理,绘制成质谱图。

质荷比的计算公式为：m/z=2U/v2

其中z为离子的电荷,U为加速电压,m为离子的质量,v为离子初加速后的运动速度。具有速度v的带电离子进入质谱分析器的电磁场中,根据所选择的分离方式,最终各种离子按质荷比(m/z)不同实现分离。

图4-15　质谱仪原理构造图

质谱仪主要有离子源、质量分析器和离子检测器三个核心部件组成(见图4-15)。电离源(ion source)是质谱仪中产生离子的装置。电离源的功能是将进样系统进入的气态样品分子转化成离子。由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大,因此,对于不用的分子应选择不同的离解方法。通常称能给样品较大能量的电离方法为硬电离方法,而给样品较小能量的电离方法为软电离方法。质谱技术中所用的离子源有多种,常用的主要有：基质辅助激光解吸离子化(Matrix Assisted：aser Desorption lonization,)、电喷雾离子化(Electrospray ionization,ESI)。

2.质谱技术在微生物鉴定和分类中的应用

质谱检测和鉴定微生物主要是基于质谱图中是否存在生物标志物。所谓生物标志物(biomarker)是微生物中含有的一些化学物质,其含量或结构具有种属特征,能够标志某一类或某种特定微生物的存在,主要包括蛋白质、脂肪酸、核酸、糖类等生物分子。目前用于微生物检测鉴定的质谱技术主要是基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)、电喷雾质谱(ESIMS)等。

(1)基质辅助激光解吸飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of fight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)(www.xing528.com)

MALDI-TOF MS的原理是样品和基质混合点在金属靶盘上形成共结晶,脉冲激光照射晶体后,基质分子吸收能量与样品解吸附并使其电离(通常是基质的质子转移到样品分子上)。样品离子在加速电场下获得相同动能,经高压加速、聚焦后进入飞行时间检测器,离子的质荷比(m/z)与飞行时间的平方成正比,从而对样品进行分析。理论上讲,只要飞行管的长度够,TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的,因此MALDI-TOF MS很适合研究蛋白质、核酸等生物大分子。

世界上第一台质谱仪于1912年研制成功并广泛引用于化学领域。1975年,ANHALT等基于不同种属的细菌具有特定质量图谱,首次提出质谱可用于细菌鉴定,拉开了质谱鉴定的序幕。直到20世纪80年代末,随着软电离技术基质辅助激光解吸电离离子源的发展,质谱才开始用于易碎大分子物质如蛋白质的分析,此后,将质谱用于微生物鉴定逐渐走上了正轨。1996年,HOLLAND等首次报道了细菌不经前处理直接进行质谱分析,可获得完整细胞的MALDI-TOF MS指纹图谱。随后,KRISHANMURTHY等国外学者陆续应用质谱成功对细菌进行种属水平鉴定。随着质谱技术的不断发展和完善,有关应用MALDI-TO FMS快速而正确鉴定临床细菌、真菌和酵母菌的研究日益增多。

MALDI-TOF MS以其操作简便、自动化、快速、高通量等优势受到青睐,成为一种新的微生物鉴定方法。MALDI-TOF MS技术主要通过微生物蛋白质表达谱中的特征谱峰鉴定和分类细菌的属、种、株,甚至是不同亚型。蛋白质在微生物体内含量较高,细胞壁/膜上的蛋白是信号的主要来源,因此是目前被研究最多的生物标记物。基于质谱的蛋白质组学技术系统在微生物鉴定和分类的应用,可完成三个方面的工作：(1)对于一系列已知的微生物,可获得MALDI-TOF MS数据库,即建立已知微生物的标准蛋白质组指纹质谱数据库。(2)对于未知微生物,则制备未鉴定微生物样品,利用MALDI-TOF MS获得质谱数据,再采用提供的软件包,将获得的质谱数据与已知微生物的标准蛋白质组指纹质谱数据库进行比较,以鉴定具有相同或相似质谱数据的微生物,再建立未知微生物标准蛋白质组指纹质谱数据库。(3)采用提供的软件包工具,可以利用已建立的已知和未知微生物标准蛋白质组指纹质谱数据库用于临床、环境、农业、食品等未知样品的鉴定。这方面的工作是在质谱采集谱图后由BioTyper软件进行微生物如细菌、酵母菌、真菌等的鉴定、分类和去冗余。

MALDI-TOF MS技术最大特点是对样品纯度要求不高,对盐、缓冲液、去垢剂等杂质有一定耐受力,因此样品可不经分离纯化,直接点样。待测样品通常是单菌落和细胞提取液。对单菌落的分析是该技术的一大特点,通常是将单菌落直接涂在样品靶上,再用基质覆盖,只需几分钟即可得到细菌的全细胞图谱。MALDI-TOFMS技术也可分析细胞提取液,主要是通过溶剂提取的方法将微生物细胞壁或细胞膜破碎,让被提取物质充分释放出来。

(2)电喷雾质谱(electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)

电喷雾质谱的基本原理是：从毛细管流出的液态样品在雾化气流下转变成带电小液滴(smalldroplet)进入离子化室,离子化室内干热的气体使液滴蒸发,液滴表面电荷强度逐渐增大,最后形成带有单个或多个电荷的分子离子进入检测器。

ESI-MS技术主要也是通过分析蛋白质、脂质、核酸等大分子物质来鉴定微生物,完成对不同属、种、甚至是亚型的区分。但是该技术易受盐、缓冲液的干扰,这些杂质的存在很容易降低仪器灵敏度,影响图谱的重现性,因此通常情况是将ESI-MS与HPLC、毛细管区带电泳(capillaryzoneelectrophoresis,CZE)等。

多种高效分离手段相结合,以便很好的分析复杂样品,这也是MALDI技术所不具备的特点。电喷雾离子化产生多电荷离子,这一特点使质荷比降低到多种质量分析器都可以检测的范围,可更准确测定分子量。与ESI相连的质谱检测器多为四极杆,离子阱,虽然它们的质量检测上限并不高,但具有较高的质量分辨率,因此可以在质量较低的范围内检测到生物大分子。多电荷分子离子峰能提供各组分更准确的片段信息,但与单电荷离子峰图谱相比,却增加了图谱的复杂性和分析难度。

3.微生物鉴定质谱仪应用现状

随着质谱技术的发展,尤以基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)在微生物鉴定中的应用,因其操作简单快速、高通量、自动化、高灵敏度和高分辨率的特性在国内已经被很多医院及检测机构认可并应用。目前商品化的微生物鉴定质谱仪有MALDI BioTyperTM(Bruker Daltonics),SARAMIS(Shimadzu & Anagnostec),MALDI micro MXTM(Waters Corporation)和VITEK MSTM(bioMerieux)。其中MALDI BioTyperTM于2011年获得欧洲CE认证;VITEK MS于2011年获得欧盟体外诊断认证和美国FDA准入,VITEK MS与MALDI BioTyperTM分别于2012年8月和2014年5月通过SFDA批准。

尽管质谱技术在微生物研究的各领域正发挥着独到的作用,但在应用上仍存在一些限制。首先是昂贵的价格使得一般实验室难以承受;其次是微生物样品产生的质谱图比纯化学品的质谱图复杂得多,要用专门的软件进行分析;诸如蛋白、多肽等生物标志物数据库的建立还应不断完善,以便于未知样品的匹配鉴定。相信未来几年内软件的开发会使仪器更易于操作,图谱更易于分析,各种谱图数据库的建立和完善会使鉴定结果更准确、更快捷。