核酸测序技术的应用与发展

(一)DNA测序技术的发展

快速和准确地获取生物体的遗传信息对于生命科学研究一直具有十分重要的意义。对于每个生物体来说,基因组包含了整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映基因组DNA上的遗传信息,进而比较全面地揭示基因组的复杂性和多样性,因而在生命科学研究中扮演了十分重要的角色。

1.第一代测序技术

第一代测序技术指的是以Gilbert法和Sanger法为代表,包括一些其他的测序方法,如焦磷酸测序法、连接酶测序法、杂交测序法等测序方法。第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组及单细胞模式生物如啤酒酵母,再到一些小型基因组生物如水稻、玉米、秀丽新小杆线虫,再到人类基因组草图等大量的测序工作。为第二代,第三代测序技术的产生和发展奠定了基础。也是目前为止测序工作最主要采取的技术。

早在1954年,Whitfeld等就提出了利用磷酸单酯酶的脱磷酸化作用以及高碘酸盐的氧化作用测定多聚核糖核苷酸链的化学降解法,这种方法从DNA链的末端逐一分解出单个脱氧核苷酸进行测序,操作烦琐,错误率大,因此没有被广泛应用。

在1977年,Gilbert等提出了化学降解法,Sanger等提出了经典的双脱氧核苷酸(ddNTP)末端终止测序法(图4-11)。Sanger测序法采用边合成边测序的思想,利用双脱氧核苷酸的2和3都不含羟基的特性,即在DNA合成反应中不能于其他核苷酸分子的磷酸基团形成磷酸二酯键,该ddNTP分子结合到DNA链上时,新链的合成即被终止。在测序时,向4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例的带有放射性同位素标记的某种双脱氧核苷酸,然后通过凝胶电泳和放射自显影,根据电泳带的位置来确定待测分子的DNA序列。和Gilbert测序法不同,Sanger测序法利用了生物反应特性即DNA复制特性,而不是纯化学方法。因而Sanger法更为高效,应用也更为广泛,被认为是一种经典的测序技术。其边合成边测序的思想被许多第二代测序方法所采用。

图4-11双脱氧链末端终止法测序原理示意图

此后,在Sanger法的基础上,标记和读取序列的方法出现了改进。如以荧光标记代替放射性同位素标记、以荧光信号接收器和计算机信号分析系统代替放射性自显影的自动测序仪。

2.第二代测序技术

尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组到人类基因组草图等大量的测序工作,但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足,并不是最理想的测序方法。经过不断的开发和测试,进入21世纪后,以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的第二代测序技术诞生了。

第二代测序技术与第一代Sanger测序法的原理相同,即基于边合成边测序的思想,在测序原理上没有本质的飞跃。但是第二代测序技术不仅保持了高准确度的特性,而且大大降低了测序成本并极大地提高了测序速度,降低了测序成本。使用第一代Sanger的测序技术完成的人类基因组计划,花费了30亿美元巨资,用了三年的时间;然而,使用第二代SOLiD的测序技术,完成一个人的基因组测序现在只需要一周左右的时间。由于第二代测序技术产生的测序结果长度较短,因此比较适合于对已知序列的基因组进行重新测序,而在对全新的基因组进行测序时还需要结合第一代测序技术。

第二代测序技术最显著的特点是先将待测序列打断成小分子序列,再用PCR技术对小分子序列进行扩增,其中克隆的扩增通过以下几种方式之一进行,如桥PCR、微乳滴PCR或原位成簇。然后用相应载体吸附小分子序列,利用Sanger法的边合成边测序思想完成测序工作。因而第二代测序技术又被称为循环阵列测序技术,这些方法所采用的技术与生物化学相当多样,但是都采用了大规模矩阵结构的微阵列分析技术,阵列上的DNA样本可以被同时并行分析。此外,测序是利用DNA聚合酶或连接酶以及引物对模板进行一系列的延伸,通过显微设备观察并记录连续测序循环中的光学信号实现的。

3.第三代测序技术(www.xing528.com)

目前兴起的Helicos公司的Heliscope单分子测序仪、Pacific Biosciences公司的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的纳米孔单分子技术,被认为是第三代测序技术。与前两代技术相比,他们最大的特点是单分子测序。其中,Heliscope技术和SMRT技术利用荧光信号进行测序,而纳米孔单分子测序技术利用不同碱基产生的电信号进行测序。

Helicos公司的Heliscope单分子测序仪基于边合成边测序的思想,将待测序列随机打断成小片段并在3'末端加上Poly(A),用末端转移酶在接头末端加上Cy3荧光标记。用小片段与表面带有寡聚Poly(T)的平板杂交。然后,加入DNA聚合酶和Cy5荧光标记的dNTP进行DNA合成反应,每一轮反应加一种dNTP。将未参与合成的dNTP和DNA聚合酶洗脱,检测上一步记录的杂交位置上是否有荧光信号,如果有则说明该位置上结合了所加入的这种dNTP。用化学试剂去掉荧光标记,以便进行下一轮反应。经过不断地重复合成、洗脱、成像、淬灭过程完成测序。Heliscope的读取长度约为30～35 bp,每个循环的数据产出量为21～28 Gb。

Pacific Biosciences公司的SMRT技术也是基于边合成边测序的思想,与单分子测序仪不同的是,该方法以SMRT芯片为测序载体进行测序反应。与其他方法不同的是该方法中荧光标记的位置是磷酸基团而不是碱基,再根据荧光的种类就可以判定dNTP的种类。此方法使得荧光强度变大而易于检测。SMRT技术实现了速度快的特性,对大量基因的测序有重大意义。

Oxfordnanope Technologies公司正在研究的纳米孔单分子技术,如前所述,使用电信号测序。原理是利用纳米孔内的环糊精相互作用,从而影响流过纳米孔的电流强度。纳米孔就是直径在纳米尺度的小孔(1～2 nm)。通常是利用固态物质或者生物分子制成的小孔。这种想法是在电场驱动下,当线状DNA分子通过小孔时,通过一些物理手段来确定碱基的序列。在全球,许多公司和组织,如Agilent,DNA Electronics,IBM,NabSys,Oxford Nanopore Technologies,Sequenom等都在进行纳米孔测序的开发,但采用的方法不同。所有以纳米孔为基础的测序技术都面临两个关键的挑战：区分4种核苷酸的速度要与DNA运动的速度相称,控制DNA通过纳米孔的速度。初步尝试测量离子电流的波动—单链DNA分子通过纳米孔时,堵塞纳米孔从而造成电压的波动。这种电流强度的变化幅度就成为每种碱基的特征,每种碱基对应不同的电信号,从而读取碱基顺序。纳米孔单分子技术的准确率能达到99.8%,而且一旦发现替换错误也能较容易地更改。但是由于技术不够成熟,更合适的材料和方法也在不断寻找和完善中。值得一提的是,这种方法突破了经典的边合成边测序的思想,直接对单分子进行测序,从而减少了合成过程中产生的误差,提高了读取的准确率。

由于第二代测序技术在测序前要通过PCR手段对待测片段进行扩增,受到DNA复制过程中正确率的限制,会由于碱基错配造成误差,因此增加了测序的错误率。并且由于第二代测序技术多适用于短序列测序,因而不太适用于未知基因组的全新测序。而第三代测序技术,通过增加荧光的信号强度及提高仪器的灵敏度等方法,使测序不再需要PCR扩增这个环节,实现了单分子测序并继承了高通量测序的优点,降低了测序的错误率。相比第二代测序技术,第三代测序技术具有更好的应用前景和更广泛的可应用领域。有与单分子测序技术并没有彻底形成完善的测序体系,如纳米材料的获取等问题依然没有得到解决,在未来的十年内,单分子测序技术将会呈持续发展的态势。

高通量是第三代测序技术的特点。这些测序技术可得到大量测序信息,因此可以在短时间内对某个组织在一段时间内合成的大量mRNA进行测序,故又被称为深度测序。这种特性对于医学研究尤为重要,尤其是对于临床医学生物标志物的检测方面。

由于使用高通量测序技术可以实现对不同组织mRNA表达差异进行检测,通过与基因组进行比较可以确定组织特异表达的基因,因此具有取代“基因芯片”技术的态势。由于基因芯片的检测范围取决于芯片上探针的信息,因此只能检测人们已知序列的特征,缺乏发现寻找新基因的能力,而高通量测序则能够很好地弥补基因芯片这方面的不足。但就目前而言,高通量测序技术建立的时间还很短,技术不是很成熟,其信息储备量也很有限;而基因芯片技术已经发展了近16年,其实验技术及后期数据分析理论已经很成熟很完备,也积累了庞大的公共数据库,因此短时间内基因芯片技术还会占据主导优势。但相信在不久的将来,第三代测序技术将会越成熟并得到更加广泛的应用。

通常将技术融合,测序通量与序列读长,测序成本与生产能力,测序运作模式作为衡量一种测序技术是否可用的指标。所以可以看出,单分子测序技术还处于进步的过程之中,面对着来自各个领域的挑战,如工程技术,生物化工,生物信息等方面。

单分子测序技术是当前生物医学研究领域的热门技术之一,是个体医学赖以实现的基础技术。并且分子测序技术能够将基因组学和系统生物学研究推向更高的层次。基因测序技术仍然会不断发展,不断改进和完善。

(二)DNA测序产品及服务市场

基因组领域大致分为设备、测序与应用这三大块,其中有含金量的是测序设备的研发与临床应用的开发。目前,测序仪市场主要被国外公司所占据,国际知名企业有罗氏454生命科学、Illumina、ABI、应用生物系统公司、Helicos BioSciences、Life Technologies、Bowtie、TopHat、Splice Map、Cufflinks等。

目前,在基因测序仪市场,特别是第二代测序仪市场,Illumina稳坐全球市场头把交椅。公开数据显示,Illumina第二代测序仪Solexa占据了全球市场约60%的市场份额。位列二三名的,是罗氏的454平台及LifeTech的SOLID平台。

国内也在积极发展第三代基因测序仪及基因检测业务,在基因组科学最基础性的设备上与基因测序仪上我国主要还是依赖于进口,这种局面对我们基因科学研究还是形成了很大的影响。生产基因测序仪,对于保护我国自己的基因资源起到了很重要的作用。如果第三代基因测序仪能够国产化,能够自主生产和制造,将极大地降低人的基因测试的成本,从目前的几十万元降到几千元的水平,由此对个人基因衍生出来的个体化的仪表也将会形成一个新的产业。国内开展基因检测业务企业有很多,其中以深圳华大基因科技有限公司为龙头,另有生工生物工程(上海)有限公司、上海美吉生物医药科技有限公司、上海敏芯信息科技有限公司、上海康成生物工程有限公司、北京贝瑞和康生物技术有限公司、北京博莱明创生物技术有限公司、北京华大中生科技发展有限公司、上海派森诺生物科技有限公司、北京怡美通德科技发展有限公司等。