凝胶成像系统在生物工程常规研究中的应用

在生物学迅速发展的今天,凝胶电泳作为主要的科研实验手段早已被广泛应用于核酸和蛋白的分离,而电泳图像的获取和相关分析主要依靠凝胶成像系统。凝胶成像即对DNA/RNA/蛋白质等凝胶电泳不同染色(如EB、考马氏亮蓝、银染、Sybr Green)及微孔板、平皿等非化学发光成像检测分析。凝胶成像系统可以应用于分子量计算、密度扫描、密度定量、PCR定量等生物工程常规研究。

(一)应用范围

除了用于蛋白质、核酸、多肽、氨基酸、多聚氨基酸等其他生物分子的分离纯化结果作定性分析外还有如下应用：

1.分子量定量

对于一般常用的DNA胶片,利用分子量定量功能,通过对胶上DNA Marker条带的已知分子量注释,自动生成拟合曲线,并以它衡量得到未知条带的分子量。通过这种方法所得到的结果较肉眼观察估计要准确很多。

2.密度定量

一般常用的测定DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)浓度的方法是紫外吸收法,但它只能测定样品中的总核苷酸浓度,而不能区分各个长度片段的浓度。利用凝胶成像系统和软件,先将DNA胶片上某一已知其DNA含量的标准条带进行密度标定以后,可以方便地单击其他未知条带,根据与已知条带的密度做比较,可以得到未知DNA的含量。此方法也适用于对PA GE蛋白胶条带的浓度测定。

3.密度扫描

在分子生物学和生物工程研究中,最常用到的是对蛋白表达产物占整个菌体蛋白的百分含量的计算。传统的方法是利用专用的密度扫描,但利用生物分析软件结合现在实验室常规配备的扫描仪或者直接用白光照射的凝胶成像就能完成此项工作。

4.PCR定量

PCR定量主要是指,如果PCR实验扩增出来的条带不是一条,那么可以利用软件计算出各个条带占总体条带的相对百分数。就此功能而言,与密度扫描类似,但实际在原理上并不相同。PCR定量是对选定的几条带进行相对密度定量并计算其占总和的百分数,密度扫描时并对选择区域生成纵向扫描曲线图并积分。

(二)凝胶成像种类

1.普通凝胶成像分析系统：可以对蛋白电泳凝胶,DNA凝胶样品进行图像采集并进行定性和定量分析,样品包括：EB、SYBR Green、SYBR Gold、Texas Red、GelStar、Fluoroscecin、Radiant Red等染色的核酸监测;以及Coomassie Blue、SYPRO Orange、各种染色的蛋白质凝胶如考染等。(或UV,EB和有色及可见样品成像)。

2.化学发光成像分析系统：成像范围涵盖UV、EB、化学发光、紫外-荧光、有色及可见样品成像。

3.多色荧光成像分析系统：成像范围涵盖UV、EB、化学发光、多色荧光、有色及可见样品成像。

4.多功能活体成像分析系统：UV、EB、化学发光、多色荧光、有色及可见样品成像和离体组织和小型动物,及大型型动物。

(三)凝胶成像系统的应用

凝胶成像系统在食源性致病菌的检测中的应用较多的是配合PFGE分型技术,进行致病微生物溯源,重复性好、分辨力强,通过对不同样品菌株的PFGE产生的电泳条带之间,以及同已知菌株的条带间的比较或者软件分析,可以快速判定菌株间的亲缘关系。

凝胶成像系统作为脉冲场电泳分型技术的必须分析设备可以通过对不同样品菌株的PFGE电泳条带之间,以及同已知菌株的条带间的比较或者软件分析,可以鉴定检测物的遗传物质信息,比较微生物亲缘关系,对于细菌性传染病的监测、传染源追踪、传播途径的调查和识别非常重要。

病原菌分子分型技术已经广泛应用于疾控系统、检验检疫、食品卫生和风险评估、军队疾控系统、畜牧兽医、医疗系统、院内感染等相关机构,发挥了重要的作用。目前凝胶成像厂家很多,市 场 上 常 见 的 凝 胶 成 像 系 统 品 牌 有UVP、Wealtec、　伯 乐、Aplegen、ProteinSimple(原AlphaInnotech)、GE、富士、柯达等。

(四)凝胶成像系统标准操作程序

1.厂家型号

厂家：美国Bio-rad,型号：Gel Doc XR+凝胶成像系统。

2.用途

凝胶成像系统是一简单易用,高性能的实时凝胶成像系统。通过软件对成像仪的自动化控制,我们可以对蛋白电泳凝胶,DNA凝胶,96孔细胞板,平皿等样品进行图像采集并进行定性和定量分析。应用范围有核酸凝胶：Ethidium bromide、SYBR Green、SYBR Safe、SYBR Gold、GelGreen、GelRed、Fast Blast;蛋白凝胶：Coomassie Blue、Copper stain、Zinc stain、Flamingo、Oriole、Silver stain、Coomassie Fluor Orange、SYPRO Ruby、Krypton;印迹膜：Colorimetric、Qdots 525、Qdots 565、Qdots 625、CY2、Alexa 488、DyLight 488、Fluorescein。

3.软件功能

3.1　中/英文软件,无安装次数限制,免费升级;同时具备采集图像,及数据处理功能。

3.2　专业成像及分析软件对系统进行自动控制,包括采集、优化、定量、分析图像及报告输出。

3.3　软件可自动检测泳道和条带,并自动进行分子量和浓度的分析,分析结果可输出为Excel或数据库格式,自动条带检测,自动分子量测算,自动条带浓度测算,添加各种格式的文字注释,3D图像观察及输出。

3.4　可选DPI输出,300、600及自定义DPI,满足所有期刊对图片质量要求,图像输出格式：.tif、.bmp、.png、.jpg。

3.5　软件可输出PulseNet格式数据,以便使用PulseNet软件进行分析。

3.6　报告输出：包括图像仪名称、仪器序列号、使用者姓名、成像时间、光源名称、滤光片名称、泳道图示、条带标注等。(www.xing528.com)

4.主要参数

4.1　电源：220/240 V,50～60 Hz。

4.2　图像分辨率：4 Mega pixel,CCD动态范围：>3 OD,信噪比：≥56dB,曝光时间：最短0.001　s,每0.001　s步进,实时在线积累时间：0.1　s～3000 s,紫外透射光源大小：19.4　×26 cm。

4.3　CCD控制：马达自动控制,镜头缩放：8.5　～51 mm镜头。

4.4　暗箱：密封暗箱可用于化学发光检测,兼容SYBRRGreen等非EB核酸染料。

4.5　硬件平场校正：专利的平场校正功能,使用平场校正滤光片及校正板辅助软件校正,保证成像时的背景均一,图像背景各部位的误差<5%。

4.6　光源：透射紫外(302 nm,可选254 nm,365 nm)、透射白光、侧白光滤光片、标准滤光片、平场校正滤光片。

4.7　紫外自动光闭保护制备型UV灯模式,有效保护核酸样品不发生突变;抽屉式灯箱方便进行切胶操作,UV防护板方便直接用紫外平台进行样品肉眼观察。

4.8　切胶尺：切割凝胶,荧光尺：系统检测并用于测量长度。

4.9　操作简单：放入样品后,不需要手动调整对焦、光圈、曝光时间等参数,只需要点击主机按钮即可得到成像结果。

4.10　软件可控制曝光时间以看到微弱信号,显示过饱和像素保证精确定量。

4.11　具有免染技术：不需要对蛋白凝胶进行染色、脱色,可直接在5min内对凝胶进行成像,成像效果与考染相当。

5.操作程序

5.1　打开成像仪器电源,将样品放入紫外透射仪上。

5.2　双击桌面上图标,打开Image Lab软件。

5.3　单击“新建实验协议”或者已保存的实验协议。

5.4　选择相应的应用程序,如“Ethidium Bromide”。设置成像区域及曝光时间等。

5.5　点击“放置凝胶”,并选择相应的滤光片。

5.6　通过“照相机缩放”将图像调至合适大小。

5.7　点击“运行实验协议”,系统将根据输入的曝光时间进行成像。

5.8　成像结束后,可通过图像工具对结果进行分析处理并保存。

5.9　仪器使用完后,请及时关闭电源,特别是ChemiDox XRS的CCD电源。

6.使用注意事项

6.1　请勿将潮湿样品长期放在暗箱内,以防腐蚀滤光片,更不要将液体溅到暗箱底板上,以免烧坏主板。

6.2　使用后将平台擦干净,以防有水损坏CCD;切胶时在平台上垫上保鲜膜,以防划损平台。

6.3　有在进行化学发光实验时才需要提前打开冷CCD预热30min再使用,其他操作无须预热。

6.4　请勿使用控制成像仪的电脑上网,也不要自行重装电脑操作系统或给操作系统升级。

6.5　及时取走自己的物品,注意用电安全,保持实验室清洁,不浪费。仪器不正常时,及时上报,不得自行处理。

7.设备图片

图4-10　Gel Doc XR+凝胶成像系统