电泳技术：从概念到应用

(一)电泳概述

1.概念

支持介质中的带电颗粒,在电场作用下向与其电荷极性相反的电极移动的现象。

2.电泳原理

许多分子具有可电离基团,在溶液中能形成正、负离子。

(1)缓冲液A、B中各放一电极接直流电源,则两电极间形成一恒定电场。A、B间用预先被缓冲液浸泡至饱和的支持介质连接,形成一个“桥”。

(2)将电泳的样品液滴在支持介质上。则在电场作用下,样品中带正(负)电的颗粒移向负(正)极。

(3)在样品的各种离子到达电极之前关闭电源,则样品的各种成分便按照它们的电泳迁移率被分离开。

3.应用

目前,电泳技术常用于蛋白质、多肽、氨基酸、核苷酸、无机离子等成分的分离鉴定及定量分析等。自1809年,俄国Reuss进行了第一次电泳实验至今两百多年的发展,不断出现采用不同支持物的电泳技术及各种类型的电泳仪器。目前检验机构中常用的电泳方法有醋酸纤维素膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳、毛细管电泳等。

(二)影响电泳移动速度的若干因素

1.电荷：分子的净电荷越大,其移动速度越高。

2.分子的大小：分子越大,移动越慢。

3.支持介质的性质：孔径：小孔径的有分子筛的作用,能依分子大小或带电不同等分离分子;即具有“筛分”分子的作用。粘性：阻碍泳动并起吸附作用。

4.电场强度：电压越高,分子的移动速度越大。

5.缓冲液离子强度：离子强度高,则移动速度慢,电泳区带窄而清晰;离子强度低,则移动速度快,电泳区带宽而边缘模糊。

6.温度：温度升高,则泳动速度加快。

(三)电泳技术的分类

1.根据工作原理：可分为区带、移动界面、等电聚焦、等速、免疫电泳等。

2.根据载体的性质：可分为滤纸、醋酸纤维膜、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

3.根据支持载体的位置或形状：可分为水平、垂直、板状、柱状、U型管、倒V字形、毛细管电泳等。

4.根据使用目的：可分为核酸、血清蛋白、制备、DNA测序电泳等。

5.根据用法：可分为双向、交叉、连续纸电泳、电泳-层析相结合技术等。

6.根据电源控制的不同：可分为恒压、恒流、恒功率电泳三类。

7.根据自动化程度：可分为手工、半自动、全自动等类型。

(四)电泳仪器的基本结构

分为电源、电泳槽及辅助设备三个部分。

1.电源

作用是建立电泳电场。而电场与电压有关,一般可分为：常压电泳：100～500 V,场强1～10 V/cm,分离时间较长。高压电泳：500～10 kV,场强20～200 V/cm,分离时间短。

常用的电泳电源有：普通直流电源、直流稳压电源、直流稳流电源、双稳电源、三恒电源。

电泳仪电源的主要技术指标：(1)输出电压、电流、功率;(2)电压、电流、功率稳定度;(3)输出组数;(4)连续工作时间;(5)保护措施;(6)显示方式;(7)定时方式;(8)电源电压、频率;(9)功耗。

2.电泳槽

是样品分离的场所,槽上有盖子。盖子作用：防止缓冲液的蒸发,及防止发生触电危险。

(1)电泳槽种类：

有平卧式、垂直板式、圆柱式、立板式、悬挂式等,多用玻璃、透明塑料等制成。

(2)电泳槽构成：

1)电极：耐腐蚀金属丝制成。材料有不锈钢丝、镍铬合金丝和铂金丝等。

2)缓冲液槽：有2个,分置两侧,并各自连接电源的正负极。

3)支持介质：架于两槽之间,两端分别浸入槽内缓冲液,滴上样品后进行电泳。(www.xing528.com)

3.辅助设备

(1)恒温循环冷却装置：为电泳槽的冷却板提供循环冷却水,且可按要求将温度控制在一定范围内。

(2)伏时积分器：又称电压时间积分器,用于对电泳时间的控制。

(3)凝胶烘干器：常常配套在多用电泳系统中。

(4)电泳条带的分析装置。

光密度扫描仪：可对染色后电泳条带直接扫描,得出相对百分比,绘制曲线图,计算相对面积等。由计算机控制的自动电泳仪所带的光密度扫描装置,可分析多达30种不同的电泳条带,有些还可采用荧光法分析电泳条带(如DNA测序),多种扫描方式可供选择,其结果可储存、传输和打印,并有质量控制和统计功能。其他电泳图谱分析装置。

紫外透射反射仪：需在暗室内使用。一般入射光为300 nm,反射光为254 nm和365 nm。双光观察照相仪：无须在暗室内操作。254、300和365 nm三个波长可任意选择和组合,使用方便。

照相设备：要用分辨率高的相机,并使用近焦镜头或近拍器。有时根据需要加不同的滤光片。

4.电泳所需的常用材料

(1)电泳支持物

可分两类。一是滤纸、醋酸纤维素膜、琼脂糖等;其分离作用取决于颗粒所带的净电荷,电荷相同的颗粒泳动速度相同。分辨率相对较差。二是淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶等;除有电泳作用外,还有分子筛效应。电荷相同而大小不同的颗粒由于分子筛效应在凝胶中被分开。聚丙烯酰胺凝胶适用范围广,具有更好的性能,已取代淀粉胶。

(2)缓冲液

缓冲液配制后应置于冰箱保存。缓冲液中离子有两个作用：1)使电流流动;2)维持一定的pH值。缓冲液离子强度与泳动速度有关并影响分离效果。离子强度一般在0.02～0.2之间为宜。

(3)加样器

可分为手工加样和自动加样,手工加样缺点有时会使分离条带边缘不整齐。自动加样可精确控制,条带边缘整齐,缩短电泳时间。

5.染料

(1)电泳后需用某种染料对已分离的蛋白质组分染色,使之成为肉眼可见的条带,可根据支持物或检测需要选择不同的染料。

(2)常用于蛋白质染色的染料有考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)和硝酸银(silver nitrate)、荧光染料等。常用的核酸染料有EB(溴化乙啶)、Gel Green和Gel Red、Gold View I型/II型、SYBR Green和SYBR Gold等。

(五)常用的电泳方法

1.琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。琼脂糖凝胶具有网络结构,物质分子通过时会受到阻力,大分子物质在涌动时受到的阻力大,因此在凝胶电泳中,带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量,而且还取决于分子大小,这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大,对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道,现广泛应用于核酸的研究中。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。琼脂糖凝胶电泳技术以其操作简单、耗时短而被广泛使用,但琼脂糖凝胶电泳却无法分辩差异小的DNA片段。

2.聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分离蛋白质和寡核苷酸。其原理是聚丙烯酰胺凝胶为网状结构,具有分子筛效应。它有两种形式,分别是非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE);非变性聚丙烯酰胺凝胶,在电泳的过程中,蛋白质能够保持完整状态,并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro于1967年建立,他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小(可以忽略电荷因素)。

聚丙烯酰胺水凝胶是常用的电泳支持物,具有分辨率高、样品在其中不易扩散、几乎无电渗作用等优点,但是聚丙烯酰胺的单体丙烯酰胺是强致癌物质,期望有一种无毒材料能代替聚丙烯酰胺用于凝胶电泳。

3.毛细管凝胶电泳技术

毛细管电泳技术(Capillary Electrophoresis,CE)又称高效毛细管电泳(HPCE)或毛细管分离法(CESM),是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力,根据样品中各组分之间迁移速度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术,迅速发展于80年代中后期,它实际上包含电泳技术和色谱技术及其交叉内容,是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展。1987年,Cohen发表了毛细管凝胶电泳的工作。当电泳从凝胶板上移到毛细管中以后,发生了奇迹般的变化：分析灵敏度提高到能检测一个碱基的变化,分离效率达百万理论塔板数;分析片段能大能小,小到分辨单个核苷酸的序列,大到分离Mb的DNA;分析时间由原来的以小时计算缩减到以分、秒计算。CE可以说是经典电泳技术与现代微柱分离技术完美结合的产物。

毛细管凝胶电泳的特点：所需样品量少、仪器简单、操作简便。分析速度快,分离效率高,分辨率高,灵敏度高。无须核酸染料,安全无毒;无须制胶,省时省力;无须照胶,杜绝人工分析结果误差。自动出结果,包括片段大小和样品浓度,软件可输出电泳峰图、凝胶电泳图、DNA片段碱基差异分析、相对定量分析。

4.脉冲场凝胶电泳

通常的琼脂糖凝胶电泳利用双链DNA分子在电场作用下,在凝胶中的迁移率不同而达到分离的目的。当双链DNA分子超过一定的大小以后,DNA双螺旋的半径超过了凝胶的孔径,在琼脂糖中的电泳速度会达到极限,此时凝胶不能按照分子大小来筛分DNA。此时的DNA在凝胶中的运动,是象通过弯管一样,以其一端指向电场的一极而通过凝胶。这样的迁移模式被形象地称之为“爬行”。

琼脂糖凝胶能分辨的DNA分子的大小和凝胶孔径相关。低浓度的(<0.2%)的凝胶可以分辨不大于750 kb的DNA分子,但相对而言,这样的凝胶本身很脆弱,而且需要的电泳时间极长。对于超过750 kb的样品,常用的电泳方法就无能为力了。

1984年,Schwartz和Cantor报道了脉冲场电泳的设计思想,解决了分离大片段DNA的方法。该方法在凝胶上加了正交的可变脉冲电场,使得DNA分子在“爬行”过程中,因为电场方向的变化,DNA分子以一种扭曲的状态运动,达到分离的目的。

脉冲场电泳经过数年的发展,已经成为一个非常成熟的分离大片段DNA分子的技术。现在最常用的手段是CHEF技术和DR技术。

通过微生物分型可以鉴定菌株是否一致,比较亲缘关系,对于细菌性传染病的监测、传染源追踪、传播途径的调查和识别非常重要。传统的生化分型、血清学分型等方法由于微生物容易受环境影响使得分类准确性受限制。PFGE分型技术基于限制性酶切的方法,重复性好、分辨力强,被誉为细菌分子分型技术的“金标准”。通过对不同样品菌株的PFGE产生的电泳条带之间,以及同已知菌株的条带间的比较或者软件分析,可以很快地判定为哪种菌株,是否为同一菌型,以及菌株间的亲缘关系远近。如今国际国内贸易频繁,人口及物品的流动性非常大,食品安全问题日益凸显,基于此,PFGE病原菌分子分型技术已经广泛应用于疾控系统、检验检疫、食品卫生和风险评估、军队疾控系统、畜牧兽医、医疗系统、院内感染等相关机构,发挥了重要的作用。其中最为成功的例子就是Pulse Net。

PulseNet网络首先于1996年在美国建立并成功应用,被列为21世纪公共卫生领域最具影响力的创新之一。2004年中国成立PulseNet China,截至2016年底,全国各省CDC均已加入PulseNet China网络。PluseNet通过实验室病原菌分子分型分析,结合网络技术,发现病例间的内在遗传联系,通过调查最终确认感染来源和可能的危险因素,发现传染病疫情的跨地区传播和散点暴发,为传染病暴发的早期预警、溯源、突发公共卫生事件的应对提供技术支撑,并参与了2010年6月北京、浙江、江苏、上海、天津等霍乱病例的溯源比对、2011年美国香瓜引起的单增李斯特菌暴发疫情、2011年“德国肠出血性大肠杆菌O104：H4疫情”菌株比对排查等多个调查协查工作。

目前,在脉冲场凝胶电泳系统领域,Bio Rad公司是相关仪器研发和销售历史最长、经验最多、产品最丰富、配置最高的一家公司。近几年,也有其他品牌的相关产品出现,如Biometra公司的旋转脉冲场电泳系统Rotaphor以及国产的君意东方公司的JY600MCS-2脉冲场系统等。

(六)电泳仪的选择

参照实验要求选择相应规格型号的电泳仪,市场上主要进口品牌有Bio-Rad/伯乐、GE/通用电气、Hoefer、日本ATTO、英国Cleaver、美国Labnet、德国QIAGEN、威泰克(Wealtec)公司等,国产品牌有北京六一、上海天能、上海博彩等。确保经济、耐用、简单、合理。因为高、低压电泳仪内部结构特征不同,由于高压电泳仪常附加有多项功能,而且高压电泳仪绝不能空载运行(容易造成人身伤害、内部器件损坏),导致操作上难易程度的不同等。因此正确的选购方法是：“根据实验要求的最高电压,确定购买电泳仪的规格及型号”。