1.厂家型号
厂家：美国Bio-Rad,型号：C1000 Touch型快速自动编程PCR仪。
2.产品特点用途
3.主要参数
3.1 工作电源：100～240 VAC(±10%),50～60 Hz。
3.2 显示：高分辨率超大彩色液晶显示屏,可选择图形编程、文字编程或自动编程。
3.3 内存容量：仪器自身可存储至少1000个反应程序,此外可使用U盘扩展内存。
3.4 温度范围：0℃～100℃。
3.5 温控准确度：±0.2 ℃。
3.6 温控均一性：±0.4 ℃。
3.7 具有温度梯度功能,可同时运行8个不同温度;梯度温控范围：30℃～100℃。梯度温差范围：1℃～24℃;梯度温度孵育时间：相同。
3.8 接口：5个USB A型接口,1个USB B型接口,可外接鼠标控制。
4.主要性能
4.1 可以升级为六通道荧光定量PCR仪。
4.2 配备高分辨率彩色液晶显示屏,可实现实验过程中实时显示温控及运行状态。
4.3 具有动态温度梯度功能,以验证最佳实验方案。
4.4 半导体加热制冷方式。
4.5 具有可更换反应模块功能,其可供选择的模块包括96×0.2 mL梯度单槽模块、96×0.2 mL/48×0.5 mL梯度深槽模块、48/48×0.2 mL双槽梯度模块、384孔单槽梯度模块、定量PCR梯度模块等。
4.6 当安装梯度双槽模块时,可同时独立运行两个不同的程序,供两人同时使用梯度程序。
4.7 带有程序自动编写功能,输入退火温度和扩增片断长度等信息可自动生成扩增程序。
5.操作程序
5.1 接通仪器电源,打开仪器开关,仪器自检后,显示主菜单。
5.2 在PCR管中加入样品,把管子放入仪器中,关上盖子,准备开始试验。
5.3 可以用以下几种方式运行。
5.3.1 点击RUN键：点击RUN,在文件库中选择程序。再次点击RUN或ENTER开始运行。
5.3.2 在PERVIOUS RUN文件夹中选择程序并点击RUN：选择Pervious Run文件夹选择需要运行的程序。然后点击RUN或ENTER键返回所选的程序。
5.4 在运行中可点击Pause进行程序的暂停,点击Resime可继续开始运行程序。
5.5 点击Skip Step按钮可以跳过当前步骤进入下一步,多次点击Skip Step键可跳过相应点击次数的步骤,即如后面的步骤。(www.xing528.com)
5.6 点击Cancel Run键可终止运行。
5.7 点击INCUBBATE进行样品孵育。
5.维护保养
5.1 PCR仪器需要定期检测,视制冷方式而定一般半年至少一次。
5.2 PCR反应的要求温度与实际分布的反应温度是不一致的,当检测发现各孔平均温度差偏离设置温度大于1℃～2℃时,可以运用温度修正法纠正PCR实际反应温度差。
5.3 PCR反应过程的关键是升、降温过程的时间控制,要求越短越好,当PCR仪的降温过程超过60 s,就应该检查仪器的制冷系统,对风冷制冷的PCR仪要较彻底地清理反应底座的灰尘;对其他制冷系统应检查相关的制冷部件。
5.4 一般情况如能采用温度修正法纠正仪器的温度时,不要轻易打开或调整仪器的电子控制部件,必要时要请专业人员修理或利用仪器电子线路详细图纸进行维修。
6.使用中的注意事项及常见故障的排除
6.1 假阴性,不出现扩增条带
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备;②引物的质量与特异性;③酶的质量及溴乙啶的使用;④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质;②模板中含有Taq酶抑制剂;③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白;④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚;⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应 固定不宜随意更改。
6.2 阴性
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙啶。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特 异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20μL、30μL、50μL或100μL,应用多 大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20μL后,再做大体积时,一定要摸索条件,否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率,退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪或水浴锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的。
6.3 假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除。
6.4 出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现,其原因：一是引物与靶序列不完全互补或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸)。
6.5 出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。其对策有：减少酶量,或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量,减少循环次数。
7.设备图片
图4-4 C1000 Touch型快速自动编程PCR仪
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