PCR技术在基因扩增中的应用及荧光定量PCR检测方法

(一)聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)的基本原理

PCR反应过程与细胞内的DNA复制相似,但PCR的反应体系要简单得多,主要包括DNA靶序列、引物、4种单核苷酸dNTP、耐热DNA聚合酶以及合适的缓冲液体系。PCR反应过程有以下3个步骤：1、变性。将反应体系混合物加热到94℃,维持较短时间(大约15 s～30 s),使目标DNA双螺旋的氢键断裂,形成单链DNA作为反应模板。2、退火。将反应体系冷却至特定的温度(引物的TM值左右或以下),引物与DNA模板的互补区结合,形成模板引物复合物。3、延伸。将反应体系的温度提高到72℃并维持一段时间,引物在耐热聚合酶的作用下,以引物为固定起点,以4种单核苷酸(dNTP)作为底物合成新的DNA链。以上三步作为一个循环重复的进行,每一循环的产物作为下一循环的模板。如此循环数十次,从而使目的基因得到指数级扩增,达到检测或获取基因的目的。

(二)PCR仪的分类

根据DNA扩增的目的和检测的标准可以将PCR仪分为普通PCR仪,梯度PCR仪,原位PCR,实时荧光定量PCR仪等几类。

1.普通PCR仪

一般把一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪,称之为普通PCR仪。如果要用它做不同的退火温度则需要多次运行。主要是用作简单的,对目的基因退火温度的扩增。主要应用于科研、教学、临床医学、检验、检疫等。

2.梯度PCR仪

一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件(通常12种温度梯度)的称之为梯度PCR仪。因为被扩增的不同的DNA片段其最适合的退火温度不同,通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增,从而一次性PCR扩增就可以筛选出表达量高的最适合退火温度进行有效的扩增。主要用于研究未知DNA退火温度的扩增,这样既节约时间,也节约经费。在不设置梯度的情况下亦可当做普通的PCR用。真正的梯度,是每一排管都有精确的加热控温探头,2009年为止只有美国ABI公司可以做到。其他的都是从两头的热传递来设计控温。梯度PCR仪多应用于科研、教学机构。

3.原位PCR仪(www.xing528.com)

是用于从细胞内靶DNA的定位分析的细胞内基因扩增仪。如病原基因在细胞的位置或目的基因在细胞内的作用位置等。可保持细胞或组织的完整性,使PCR反应体系渗透到组织和细胞中,在细胞的靶DNA所在的位置进行基因扩增。不但可以检测到靶DNA,还能标出靶序列在细胞内的位置。于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转变有着重大的实用价值。

4.实时荧光定量PCR仪(fluorescencer quantitive polymerase chain reaction,FQ-PCR)

实时荧光定量PCR仪+实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件,是在普通PCR仪设计基础上增加荧光信号激发和采集系统和计算机分析处理系统,形成了具有荧光定量PCR功能的仪器。其PCR扩增原理和普通PCR扩增原理相同,在PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记,使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统,得出量化的实时结果输出。

荧光定量PCR仪有单通道,双通道和多通道之分。当只用一种荧光探针标记的时候,选用单通道;有多种荧光标记的时候使用多通道。单通道也可以检测多荧光的标记和目的基因表达产物,因为一次只能检测一种目的基因的扩增量,需多次扩增才能检测完不同的目的基因片段的量。多通道利于做多重PCR,实现一次检测多种目的基因的功能。实时荧光定量PCR仪主要应用于临床医学检测、生物医药研发、食品行业、科研院校等。

在致病菌检测中FQ-PCR的应用已有很多。众所周知,炭疽杆菌作为人畜共患病的病原,尤其炭疽杆菌的芽孢可作为生物武器的病原,在很多情况下发挥了它巨大的作用。因此需要建立一种特异、快速的检测方法。在100 L纯化空气中加入炭疽杆菌细胞,用炭疽特异性引物进行FQ-PCR检测,1 h内炭疽杆菌的单个细胞就被FQ-PCR检测到,表明FQ-PCR可快速检测空气传播的细菌孢子,为阻止传染病的流行提供了灵活而强有力工具。以血红素基因为目标片段建立TaqMan探针FQPCR方法检测单核细胞增多性李氏特杆菌,检测敏感度为50 CFU,整个实验在3 h内完成。空肠弯曲杆菌是人类主要的食源性病菌之一,又由于其特殊的生长条件和容易进入不可培养但可存活状态,因此常规细菌培养鉴定结果不一定可靠。以Light Cycler为平台,建立一种基于Taqman探针的荧光定量PCR和SYBR green I能与双链DNA结合而发出荧光的特性来定量检测空肠弯曲杆菌。结果发现,所有被检测空肠弯曲杆菌均呈阳性,检测限度为5 CFU。整个检测过程在60 min内完成。说明上述建立的两种检测空肠弯曲杆菌的荧光定量PCR方法为特异、敏感、快速、简便的定量方法。

(三)PCR仪的选择

PCR仪作为分子生物学相关实验的常规仪器,每年都有很大的选购量,在选购PCR仪时首先要考虑的是基本需要,如样本管的种类,样本容量等。其次是功能性,如温度梯度功能、可调热盖功能、计算控温与模块控温、断电保护功能、软件功能、温度的准确性与精确性、升降温速率等,这些功能会在实验过程中给用户带来比较多的方便,提高效率从而节约时间。再次就是价格、使用寿命、电源可靠性、维修及使用寿命等。最后是噪音大小、外观、厂家或代理商的售后服务承诺及服务能力等。

进口品牌中美国ABI各类PCR仪、Labnet公司的梯度PCR仪、ROCHE罗氏PCR仪及诊断试剂、MJ Research实时荧光PCR仪、Bio-rad伯乐的iCycler等品牌的市场占有率较高,另外,美国Cepheid的SmartCycle,在定量PCR领域其销量仅次于ABI并远超MJ、Roche等,是世界上唯一允许16个不同条件PCR反应同时进行的定量PCR仪。国产的PCR仪的品牌也较多,有杭州博日、西安天隆、杭州郎基、珠海黑马等,国产仪器硬件上与进口的差距不大,但在软件上和方便性上还是有一定的差距。国产的普通个人PCR仪价格一般在3～6万,而荧光定量PCR仪国产品牌中目前主要是西安天隆、杭州博日、厦门安普利和上海枫岭、上海科华。