核酸提取方法及步骤概述

(一)核酸的分类和功能

核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物,为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内、生物体内核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。一般认为,生物进化即始于核酸,因为在所有生命物质中只有核酸能够自我复制。今天已知核酸是生物遗传信息的贮藏所和传递者。一种生物的蓝图就编码在其核酸分子中。核酸是1869年米歇尔(F.Miescher)在脓液的白细胞中发现的。他当时称之为核素。阿尔特曼(R.Altmann)于1889年认识其酸性后,定名为核酸。

核酸分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两大类。这两类核酸有某些共同的结构特点,但生物功能不同。DNA贮存遗传信息,在细胞分裂过程中复制,使每个子细胞接受与母细胞结构和信息含量相同的DNA;RNA在蛋白质合成过程中起着重要作用,其中转运核糖核酸,简称tRNA,起着携带和转移活化氨基酸的作用;信使核糖核酸,简称mRNA,是合成蛋白质的模板;核糖体的核糖核酸,简称rRNA,是细胞合成蛋白质的主要场所。核酸的基本结构单元是核苷酸,核苷酸含有含氮碱基、戊糖和磷酸3种组分。碱基与戊糖构成核苷,核苷的磷酸酯为核苷酸。DNA和RNA中的戊糖不同,RNA中的戊糖是D-核糖;DNA不含核糖而含D-2-脱氧核糖(核糖中2位碳原子上的羟基为氢所取代)。

提取的完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子是下游分子生物学实验的基础,所以高质量的核酸提取是至关重要的,提取方法的灵敏度、特异性也将直接关系到后续试验的成败。

(二)核酸提取方法和步骤

1.细胞裂解

裂解原理：在核酸提取过程中,细胞裂解是非常重要的。经典的裂解液几乎都含有去污剂(如SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20等)和盐(如Tris、EDTA、NaCl等)。盐的作用,除了提供一个合适的裂解环境(如Tris),还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏(如EDTA)、维持核酸结构的稳定(如NaCl)等。去污剂则是通过使蛋白质变性,破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质,从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶,利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段,促进核酸与蛋白质的分开,同时,也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂(如GIT、GuHCl等)裂解的,该方法已经成为RNA抽提的主流,却不是基因组DNA抽提的主流。

细胞的裂解方法：细菌细胞破碎方法有以下几种：(1)机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法,关于超声波处理法,要设定好超声时间和间隙时间,一般超声时间不超过5s,间隙时间最好大于超声时间。(2)化学试剂法：用含SDS或CTAB的溶液处理细胞,在一定的pH环境和变性条件下,细胞破裂,蛋白质变性沉淀,核酸被释放到水相,pH环境则由加入的强碱(NaOH)或缓冲液(TE、STE等)提供,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀,缓冲液中的一些金属离子螯合剂(EDTA等)可螯合对核酸酶活性所必需的金属离子Mg2+、Ca2+,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。(3)反复冻融法：将细胞在-20℃以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。(4)煮沸法：煮沸时将样品中的DNA通过核酸裂解液的作用释放出来,离心沉淀后将杂质去除,上清液即可用做PCR扩增。(5)酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶、蛋白酶K等,都可使细胞壁破碎,核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质,促进核酸的分离。其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-(1,4)键水解。蛋白酶K能催化水解多种多肽键,其在65℃及有EDTA、尿素(1～4 mol/L)和去污剂(0.5 % SDS或1% Triton X-100)存在时仍保留酶活性,这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。在实际工作中,酶作用、机械作用、化学作用经常联合使用。具体选择哪种或哪几种方法可根据细胞类型、待分离的核酸类型及后续实验目的来确定。

2.核酸提取

核酸提取包含样品的提取和纯化两大步骤。提取是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程,纯化则是使核酸与裂解体系中的其他成分,如蛋白质、盐及其他杂质彻底分离的过程。其中对于RNA提取过程中都有五个关键点,即样品细胞或组织的有效破碎;有效地使核蛋白复合体变性;对内源RNA酶的有效抑制;有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离;对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。目前市场上有多种总RNA的试剂盒快速提取,此外还可以用氯化锂法提取总RNA、蛋白酶-热酚法。

DNA提取常用的提取方法有碱裂解法、煮沸法、浓盐法、阴离子去污剂法、水抽提法、硅胶膜法、磁珠法等。

(1)碱裂解法：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的。

(2)煮沸法：煮沸时将样品中的DNA通过核酸裂解液的作用释放出来,离心沉淀后将杂质去除,上清液即可用作PCR扩增。

(3)浓盐法：利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同,将二者分离,常用的方法是用1M氯化钠提取,得到的DNP黏液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间,而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来。

(4)水抽提法：利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA,然后将沉淀溶于水中,使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液。在上清中加入固体氯化钠调节至2.6 M加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出。然后分别用66%,80%和95%乙醇以及丙酮洗涤,最后在空气中干燥,即得DNA样品。此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用。为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS。

(5)阴离子去污剂法：用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA。由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA。

(6)硅胶膜法(图4-1)：可用于手工提取,也可用于自动化提取。

图4-1　硅胶模法核酸提取

裂解：破坏蛋白质外壳,释放核酸。

结合：核酸被二氧化硅捕获。

洗涤：通过用不同的缓冲液洗涤,去除蛋白质等不需要的杂质。

洗脱：将结合在二氧化硅上的核酸洗脱。

(7)磁珠法(图4-2)：一般用于自动化提取,生物磁珠是一种新型的功能化固体载体,其表面包被有活性基团,可以与多种生物活性物质发生偶联,兼具有液体的流动性和固体磁性材料等特点,在外磁场的作用下可以定向移动和集中,当撤去外磁场后,稍加振荡或抽吸又可均匀分散于液体中,从而使固液相的分离变得十分快捷方便,通过简单的洗脱可以得到纯度很高的靶向物质。(www.xing528.com)

图4-2　磁珠法核酸提取

几种提取纯化方法比较见表4-1：

表4-1　核酸纯化方法比较

3.核酸纯化

裂解完成后,液体体系中就包括了游离的核酸、蛋白质及其他大分子杂质、盐,纯化就是将核酸与其他游离成分分离的过程。目前在科研领域广泛使用的核酸纯化技术主要可以分为两大类：使用介质的和不使用介质的,使用介质的,一次就将核酸与其他所有杂质分开;不使用介质的,一定是首先将核酸和盐与大分子杂质分开,再通过沉淀核酸使核酸与盐分开。

4.核酸的洗涤

核酸洗涤也是提取过程中非常重要环节。洗涤,首先一定要将沉淀悬浮起来;第二就是要控制一定的时间,尤其是当核酸沉淀比较大时,使核酸沉淀最终蓬松;第三是少量多次;第四则是去上清要彻底。

5、核酸的溶解和保存

(1)核酸溶解：纯化后的核酸,最后多使用水或者低浓度TE缓冲液溶解,其中RNA以水为主,DNA则多以弱碱性的Tris或者TE溶解。经典的DNA溶解方法多提倡使用TE溶解,认为EDTA可以减少DNA被可能残留下来的DNase降解的风险;如果操作过程控制得当,DNase的残留几乎是可以忽略的,完全可以直接使用Tris或者水(pH值接近7)溶解DNA。

(2)核酸保存：核酸在保存中的稳定性,与温度成反比,与浓度成正比。一般的我们选择,-20℃或-70℃保存的稳定。如果温度不合适,保存中核酸发生降解或者消失,首要原因是酶残留导致的酶解,第二个原因则是保存核酸溶液的pH值不合适导致的水解(RNA在弱酸性更稳定,而DNA在弱碱性更合适)。

6.核酸质量的检测

将抽提好的核酸直接用于后续的实验,是唯一可靠的检测方法;其他的检测方法都是相对的。目前用于正式实验前检测核酸质量的方法,一是电泳,二是紫外分光光度仪。此外很多分子实验室选用超微量核酸蛋白测定仪可以用于测定用于核酸、蛋白定量以及细菌生长浓度定量。电泳检测的主要是核酸的完整性和大小,只要核酸没有超出电泳分离范围,该方法还是非常可信的,电泳还可以用于估计核酸的浓度,也可以提供某些杂质污染的信息,但其准确度与经验有关。

(三)核酸提取试剂盒及核酸提取仪

1.核酸提取试剂盒

目前实验室常用的核酸提取试剂盒中,进口品牌主要有德国QIAGEN,美国Promega、invitrogen、Bio-red、Sigma、Ambion、Thermo、GE,日本TAKARA、TOYOBO,瑞士Roche等。国产品牌主要有Tiangen(天根)、Omege(广州飞扬生物工程有限公司)、Transgen、康为世纪、北京卓诚惠生、深圳生科原、上海之江等。

2.核酸提取仪的选择

核酸提取仪,是应用配套的核酸提取试剂来自动完成样本核酸的提取工作的仪器,核酸提取仪分为两类：一类是大型的自动化的,一般称为自动液体工作站;另一类是小型自动核酸提取仪,利用封装好的配套试剂自动完成提取纯化过程。大型自动液体工作站因为设备成本高昂,运行成本高,适合一次提取几千个同一种类标本,所以真正得到应用的比较少;而小型自动化的仪器,因为仪器设备和运行成本低,操作方便得到越来越多的应用。

几乎在每个实验室,与生物分子相关的分离纯化工作都是十分重要,且必不可少的。但要对多个样品进行纯化还是相当困难的,不仅需要选择合适的纯化技术,而且工作量也特别大,很难满足当前飞速发展对高通量样品进行提取纯化的需求。

核酸提取从经典方法到硅膜吸附法、再到磁珠分离法,从手动到全自动。这也是核酸提取的历史。国内已获得注册证的核酸提取仪的厂家及产品进口8条,国产17条,进口品牌有法国梅里埃、贝克曼库尔特、BIONEER公司、德国QIAGEN、瑞士HAMILTON Bonaduz AG哈美顿博纳图、德国Chemagen。目前国内进口核酸提取仪中以ABI,Thermo等最多见,同时国内的核酸提取仪市场也在日益增长,国产品牌有苏州天隆、西安天隆、上海科华、艾康生物、上海之江、烟台澳斯邦、嘉兴凯实、湖南圣湘、宁波基内、广东凯普、台湾圆点奈米。

吸管式：是通过自动移液装置来进行,通过自动移液装置来加入裂解液、磁珠吸附;抽走裂解液,加入漂洗液,磁珠吸附,抽走漂洗液,加入洗脱缓冲液。抽吸法为了在去除废液的时候不抽走磁珠,移液器不能靠磁珠太近,以防磁珠连同废液被抽掉,这样每一次抽废液的时候总有一小部分不能彻底地抽走,特别是磁铁在底部的装置,因为磁珠被磁铁吸附在底部,所以移液器不能靠底部太近,这样漂洗液就不能完全去除,残留的漂洗液中的盐和乙醇会影响后面的洗脱效率和PCR成功率;磁铁在侧面的装置残留的液体会少些,但是洗脱的效率也不好,依靠DNA自行溶解到洗脱缓冲液中,需等半小时以上,所以有些96自动核酸提取工作站,提取一轮的时间需要150min。国外品牌有Roche、Qiagen、生物梅里埃、富士等。

磁笔式(磁珠分离法)：通量通常有8、16、32、96通道,相对于吸管式,磁珠法的优点是每一步的液体不残留,因为磁棒只带走磁珠,转移到下一个步骤相应的反应孔中,另外选择磁棒法的提取仪器最好要功能更齐全的,比如可以加热,每个加热槽最好独立温控,这样可以设置加热、裂解、洗脱的不同温度,另外很重要的一点是,带动磁棒的电机要能带动磁棒进行液体的快速混匀和搅拌,这样才有利于自动化和有助于裂解和漂洗彻底。国外品牌有Chemagen、Bee Robotics、Thermo、德国耶拿、Promega、日本Precision、ABI、贝克曼,国内品牌有厦门欧达科、杭州博日、西安天隆、台湾圆点奈米、台湾瑞基、科华生物、厦门致善、上海浩源(台湾基亚)。