分子生物学技术在菌株鉴定中的应用

随着人们生活水平的不断提高,食品安全问题越来越受到人们的重视,微生物对食品的污染问题也相应地备受关注。微生物包括细菌、真菌等,有些微生物还是致病菌,对人体的危害很大,因此食品中微生物的检测非常重要。近15年人们对微生物的鉴定分型进行了大量的研究,将其发展大致分为两个阶段。

第一阶段：依据表型鉴定分型。主要通过培养特性、生理生化特性、革兰氏染色等形态学特征进行鉴定分型,此阶段主要从20世纪80年代到21世纪初,到目前这种分型仍沿用。

第二阶段：分子生物学方法鉴定分型。主要方法有蛋白质飞行质谱、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增的多态性DNA(RAPD)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、细菌的核糖体基因分型(Ribotyping)、多位点序列分析(MLST)、扩增片段长度多态性(AFLP)、重复序列扩增(rep-PCR),此阶段主要是21世纪初至今。从现在到未来5～10年中确定目标基因的每个碱基的基因序列分析技术将是新的微生物的鉴定分型研究趋势。

(一)依据表型鉴定分型

1.微生物鉴定分型的形态学方法

主要依据微生物的形态和生理生化反应等特征来进行微生物的分类和鉴定。用微生物的形态特征来鉴定微生物是由于微生物的形态比较单一,容易分辨;用微生物的生理生化反应特征来鉴定微生物主要是依据微生物细胞壁的组成、微生物发酵产物和微生物对碳源、氮源等养分的利用以及测定微生物特异性酶。由于各种微生物所具有的酶系统不完全相同,对许多物质的分解能力亦不一致。因此可利用不同底物产生的不同代谢产物来间接检测该微生物内酶的有无,从而达到检测特定微生物的目的。如沙门氏菌能产生辛酯酶,这一性能是除沙门氏菌外的各属肠杆菌科细菌所不具备的。但是,这种方法相对比较烦琐、耗时,因此近年来被全自动微生物生化鉴定系统逐步替代。全自动微生物生化鉴定系统实际上是将多个生化反应有效整合、浓缩于商业化的板卡上,方便实验室进行微生物的鉴定。该系统具有以下优点：第一,生化反应数量多,商业化的卡板最多可集合45～46种生化反应;第二,实验操作标准化,节省大量人工;第三,鉴定速度快,一般3～4h即可出鉴定结果。基于以上优点,目前,全自动微生物生化鉴定系统已经作为实验室中微生物的日常鉴定手段。除此之外,全自动微生物生化鉴定系统还具有细菌的MIC值测定和耐药表型的检测等作用。

2.免疫学检测方法

免疫学检测方法是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验方法,其基本原理是抗原抗体反应。抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。随着学科间的相互渗透,免疫学涉及的范围不断扩大,新的免疫学检测方法层出不穷。免疫学方法的应用范围亦在日益扩大,不仅成为多种临床疾病诊断的重要方法,也为众多学科的研究提供了方便。

免疫学检测技术是食品检测技术中的一个重要组成部分,主要方法有血清免疫学方法、荧光免疫技术、酶免疫技术、放射免疫技术、免疫胶体金检测技术、免疫印迹技术等,免疫学技术具有特异性强、准确性高、检测速度快等优点,在食品检测中将具有广泛的应用前景。利用免疫学检测技术可检测细菌、病毒、真菌、各种毒素、寄生虫等,还可用于蛋白质、激素、其他生理活性物质、药物残留、抗生素等的检测,其检测方法简便、快速、灵敏度高、特异性强,特别是单克隆抗体的发展,使得免疫检测方法特异性更强,结果更准确。

(二)分子生物学方法鉴定分型

分子生物学及分子遗传学的发展,使人们对微生物的认识逐渐从外部结构特征转向内部基因结构特征,微生物的检测也相应地从生化、免疫方法转向基因水平的检测。近年来,随着分子生物学和微电子技术的飞速发展,快速、准确、特异检验微生物的新技术、新方法不断涌现,微生物检验技术由培养水平向分子水平迈进,并向仪器化、自动化、标准化方向发展,提高了食品微生物检验工作的高效性、准确性和可靠性。依据细胞物质进行微生物鉴定技术主要包括蛋白质的检测和DNA的检测,是目前微生物鉴定技术的两个发展方向。(www.xing528.com)

1.基于蛋白质的鉴定技术

目前常用的微生物鉴定方法都是基于微生物的形态学、细胞生理生化,以及核酸基础建立的。自20世纪90年代,微生物鉴定系统不断发展,自动化程度不断提高,但仍然是建立在传统的生化和核酸基础上。近年来,基于蛋白质组学的质谱技术凭借其高灵敏度、高通量、快速等特点在微生物检测和鉴定方面得到快速发展。质谱技术主要是利用特定离子源将待测样品转变为高速运动的离子,这些离子根据质量/电荷比的不同在电场或磁场作用下得到分离,并用检测器记录各种离子的相对强度,形成质谱图用于分析,提供可靠的鉴定结果。此外,质谱还是一种通用技术,它可以检测到所有类型的病原体,即病毒、植物细菌、真菌及其孢子,寄生原生动物,并且需要样品量很少,可少于104个微生物。目前采用质谱检测和鉴定微生物主要基于质谱图中是否存在特异性的标记物的分子离子。因此,不同微生物具有不同的质谱图,即微生物指纹谱。目前用于微生物检测鉴定的质谱技术主要是气-质联用技术(GC-MS)、基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)、电喷雾质谱(ESI-MS)及热裂解亚稳态原子轰击质谱(Py-MAB-MS)等。

2.基于DNA检测的鉴定技术

基于DNA检测的鉴定技术主要有16S rDNA(核糖体DNA)测序技术、PFGE(脉冲场凝胶电泳,一种分离大分子DNA的方法)和全基因组测序技术等。

在DNA检测技术方面,16S rDNA基因是细菌核糖体DNA的一部分,被称为细菌的“活化石”,该基因进化速度十分缓慢,具有生物钟的特点,已经作为细菌系统发育的目的基因,16S rDNA序列测定是科研领域细菌分类和鉴定的金标准。

目前,常见的商业化测序系统有针对细菌16S rDNA中的500 bp保守序列进行测序、针对真菌的28S rDNA的D2基因区域进行测序等。该方法获得的数据有利于致病菌的溯源分析,但是操作过程具有一定的复杂度,耗时较长。另外,基因测序仪和测序耗材试剂的价格较贵,因此不利于在应用层面进行推广。

脉冲场凝胶电泳(PFGE)是一种分离大分子DNA的方法。此种方法的原理是将细菌包埋于琼脂块中,用适当的内切酶在原位对整个细胞染色体进行酶切,酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向的不断交替变换和适合的脉冲时间等条件作用而得到良好分离的方法。

PFGE的分型能力极强,可区分菌株水平的差异,目前被全世界各个国家普遍使用。通过PFGE分型可以对细菌性传染病、食源性致病菌进行监测,同时可以进行分子流行病学的调查,但是操作较为烦琐,需要较高的实验技能方可掌握。

全基因组测序技术可以对菌株进行最为有效的分型,即使是16S差异不大的菌株,也可以通过分布在整个基因组上的单核苷酸多态性位点进行区分,是目前分型能力最为强大的技术之一。但全基因组测序用于微生物鉴定工作的主要障碍在于使用成本高和专业的数据分析。

综上所述,微生物鉴定分型方法多种多样,各种方法都有其优缺点,为了弥补各自的不足,进一步提高灵敏度和特异性,可以采用多种方法联合使用的策略。例如可以先利用质谱鉴定速度快的优势迅速判断致病菌,然后再利用分子生物学的手段进行分型和流行病学的调查。选择检测方法应考虑到自身所拥有的条件,检测所要求达到的灵敏度,而提高灵敏度、去除假阳性是检测方法发展的趋势。此外,近年来,随着计算机技术的不断发展,微生物鉴定分型将向着高度自动化和开发简便的快速检测技术两个方向发展。分子生物学技术通过自动化仪器的使用,将在病原菌诊断、鉴定和耐药基因检测方面逐步应用于食品安全及临床检测。生物芯片技术的发展和应用,最终将彻底改变病原菌检验的现状和传统观念,实现高效、高质和廉价的统一。随着各学科的交叉发展,会出现越来越多的新的检测技术。