Luminex200流式荧光点阵分析仪简介

1.产品及型号

厂家：美国Luminex Corporation,型号：Luminex 200。

2.产品特点

Luminex 200在国内又称为“液相悬浮芯片技术”“多功能流式点阵技术”“液相芯片分析技术”“流式荧光检测技术”“多功能多指标并行分析技术”“(微球)悬浮阵列技术”等。它有机整合了荧光编码微球技术、激光分析技术、流式细胞技术、高速数字信号处理技术、计算机高速运算等多项最新科技成果,具有自由组合、高通量、高速度、低成本、准确性高、重复性好、灵敏度高、线性范围广、无须洗涤、操作简便、在同一平台上即可实现蛋白质和核酸的检测等优点。传统ELISA方法和液相芯片法的比较见表3-13。

表3-13　传统ELISA方法和液相芯片法的比较

3.用途

液态悬浮芯片是继平面芯片之后的一种新型芯片技术,是一种非常灵活的多元分析平台,在核酸、蛋白质等生物大分子的高通量分析中具有巨大的应用潜力,可用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体配体研究等。目前在基因组学研究、蛋白质组学研究、药物开发、基础研究和临床诊断等方面的应用十分广泛,近几年来以此为平台的产品开发和应用十分活跃,研究者既可以根据研究需要自行制备探针交联微球,建立反应体系,也可使用种类繁多的商品化试剂盒进行分析。大体说来,液态悬浮芯片技术的应用包括两大部分：液相蛋白芯片和液相基因芯片,前者主要是基于抗原抗体反应而后者实质为核酸杂交。包括：

癌症标志物检测(Cancer Markers);

心脏标志物检测(Cardiac Markers);

细胞信号传导分析(Cellular Signaling);

细胞因子、趋化因子及生长因子检测(Cytokines，Chemokines，and Growth Factors);

内分泌激素检测(Endocrine);

分型(Isotyping);

基质金属蛋白酶检测(Matrix Metalloproteinases);

代谢标志物检测(Metabolic Markers);

神经生物学研究(Neurobiology);

转录因子/核受体检测(Transcription Factors/Nuclear Receptors);

microRNA定量检测基因表达谱基因分型;

囊性纤维化基因检测(Cystic Fibrosis);

细胞色素p450(Cytochrome p450);

过敏测试(Allergy Testing);

自身免疫病检测(Autoimmune Disease);

HLA基因检测(HLA Testing);

感染性疾病检测(Infectious Disease);

疫苗测试(Vaccine Testing);

新生儿筛查(Newborn Screening);

生物防御/环境监测(Biodefence/Surveillance)。

4.工作原理

用不同比例的两种红色荧光染料将直径为5.6μm(或6.5μm)的聚苯乙烯微球染成不同的荧光色,从而获得多达100种荧光编码的微球。把针对不同待测物的抗体分子或者基因探针以共价交联的方式结合到特定的编码微球上,每个编码微球都对应相应的检测项目。先把针对不同待测物的荧光编码微球混合,然后加入待测物质或者待测的扩增片段,所形成的复合物再与报告荧光素发生结合反应。微球在流动鞘液的带动下单列依次通过红绿激光,红激光用来判定微球的荧光编码,绿激光用来测定微球上报告分子的荧光强度,从而达到快速准确的检测目的。

Luminex 200分析仪中有两条流体通道。第一条通道包含一个控制标本提取的注射器驱动装置。此装置可以从少量反应中提取少量标本。此注射式系统可将指定数量的标本从标本容器中取到试管中。标本以稳定的速度注入试管中进行分析。分析完成之后,第二条射流通道用Luminex xMAP鞘液将标本通道自动清洗干净。该过程可清除残留在管子、阀门和探测装置中的标本。正向气压将第二条射流通道中的鞘液送到试管和标本通道中。Luminex xMAP鞘液是将标本传送至光学元件的媒体。用标本探测装置通过Luminex XYP仪器,从96孔微量滴定盘中获得分析标本,并将其注入试管底部。然后,标本以减缓的速度随鞘液一起流动,形成狭窄的标本核心,以确保每一粒微球都能被分别照亮。标本的注射速度应使xMAP微球以一系列单独对象的形式进入光学通道。Luminex SD系统使您无须重注鞘液瓶,即可连续分析标本。它能从未加压的散装鞘液容器中自动吸取鞘液,以确保储液器中始终保持一定量的加压鞘液。一个20公升鞘液容器中的鞘液,即能够满足48小时甚至更多时间的正常操作需求。

5.主要参数见表3-14。

表3-14　主要参数

续　表

6.操作程序

6.1　开机操作

开机前检查鞘液和废液液面,及时添加更换鞘液和清空废液桶。开机顺序为：SD鞘液箱→Luminex200主机→XYP高通量操作平台→电脑,双击桌面上的图标,进入软件界面。

6.2　系统预热(Warmup)

仪器打开并提示软件连接正常后,系统会自动进行激光预热,预热的时间为半个小时。注意：系统开启后闲置4 h以上,需要再次预热。

6.3　仪器开机清洗和校准

预热完毕,仪器开机清洗需要进行的程序为：Prime→Alcohol Flush→wash→wash,清洗完之后需要进行“Calibration”和“Performance Verification”(系统校准试剂盒提供所有相应数据)。

Calibration程序需要加的试剂为：CAL1,MagCAL1和CAL2;Performance Verification程序需要加的试剂为：CON1,MagCON1,CON2,Fludics1和Fludics2。具体操作如下：

在AMP板(图3-21)的中间的两个孔里面加入水和70%异丙醇或者70%乙醇在AMP板右侧的两列按照提示加入相应的校准试剂。

图3-21　AMP板示意图

6.3.1　进入“Maintenance”界面,选择“System Initialization”。

6.3.2　将AMP板放入仪器,点击“RUN”,开始运行程序。

注意：Calibrate kit和Performance Verification kit中的所有试剂在加入前必须从2℃～8℃恢复到室温,并进行漩涡混合30 s以上才能使用,每孔加入5滴,不能稀释。

6.4　探针高度调节

6.4.1　取下覆盖标本探测装置区域的透明塑料护罩。

6.4.2　在总高度不超过0.75英寸(19 mm)的96孔微量滴定盘中放入合适的校准工具。

·带有平底孔的标准板：将两个较大的(直径为5.08 mm)校准盘叠放在一起,并将其放入所选的孔中。

·滤膜板：将三个较大的(直径为5.08 mm)校准盘叠放在一起,并将其放入所选的孔中。

·带有平底孔的半容量板：将两个较小的(直径为3.35 mm)校准盘叠放在一起,并将其放入所选的孔中。

·圆底(U形底)板：将两个更小的(直径为3.35 mm)校准盘叠放在所选的孔中。

·锥形孔板：在所选的孔中放入一个校准球。

·选择Maintenance(维护)标签,然后单击Eject/Retract(弹出/退回),弹出微量滴定盘托盘。将96孔微量滴定盘放在Luminex XYP仪器微量滴定盘托盘左上角的A1位置处。

6.4.3　检查是否在软件中选择了正确的位置,以及您是否使用了合适数量的校准盘。

6.4.4　单击Eject/Retract(弹出/退回),退回滴定盘。

6.4.5　将探测装置支架上的探测装置调节螺母松开三分之一至二分之一圈。将此支架向上推,直到它触到调节滑块的顶部。拧紧翼形螺钉。

6.4.6　Sample Probe Down(降低标本探测装置),降低标本探测装置。

6.4.7　轻轻向下推动探测装置,直到刚好触及校准盘或校准球的顶部。(www.xing528.com)

6.4.8　拧紧探测装置调节螺母。注意：确保微量滴定盘没有歪斜。微量滴定盘歪斜可能会导致探测装置高度调节不当。只要在软件中指定某个孔,即可将校准盘放在其中。

6.4.9　单击Sample Probe Up(升高标本探测装置),升高标本探测装置。

6.4.10　更换覆盖标本探测装置区域的透明塑料护罩。

6.5　Luminex200系统校准失败解决方案

6.5.1　首先检查系统的压力值和温度是否在规定范围内。

6.5.2　确保所有的校准试剂和控制试剂已恢复到室温,充分摇动混匀试剂瓶,每个检测项目需滴加5滴试剂。

6.5.3　检查系统中所有校准试剂与控制试剂的Target值是否与试剂瓶上的Lot信息一致。

6.5.4　确保实验中各个试剂的加样孔与软件中的输入一致。

6.5.5　检查探针高度,确定探针高度是否合适,如果有需要重新调整探针高度。

6.5.6　清洗探针：将探针取下后,用10mL的注射器或者超声水浴清洁探针。如果使用超声水浴,将探针置于超声水浴底部2～5min。如果用注射器,用蒸馏水从底部冲洗探针直到出现4～5条水柱。

6.5.7　对系统进行清洗程序,除去管路中的气泡与阻塞物：

6.5.8　若要去掉试管中的阻塞物：单击Backflush(逆流清洗),然后单击OK确定您想要逆流清洗系统。

6.5.9　若要去除标本管和试管中的气泡。

6.5.10　在“Maintenance”标签上,单击Eject/Retract(弹出/退回)。

6.5.11　打开一个确认对话框提示您将溶液放到储液器中。

6.5.12　将70%的异丙醇或70%的乙醇放到储液器中。

6.5.13　单击OK(确定)。滴定盘托盘退后,然后系统开始进行Wash程序。

6.5.14　运行3次Backflush,2次Alcohol Flush和3次Wash程序后,再次进行校准。

7.设备的维护及保养

7.1　日常维护

7.1.1　开机前检查鞘液和废液液面。

7.1.2　系统开启或开启后闲置4 h以上,需要进行Warmup。

7.1.3　预热完毕,进入Maintenance界面,点击Prime。

7.1.4　弹出XYP板架,在加液槽中添加1.2mL的70%异丙醇或者70%乙醇,收回板架。7.1.5　Maintenance界面下点击Alcohol Flush。

7.1.6　在加液槽或者对应的孔板中加入去离子水,点击Wash,完成清洗操作2次。

7.1.7　如果需要,调整探针高度。每次移动探针后,或者更换不同型号的实验孔板时,需要重新调整探针。

7.1.8　如果需要,对仪器进行校准。仪器的正常校准每月进行一次。

7.1.9　对实验孔板进行读数分析。以下10～12步操作,也可以根据xPONENT软件自带的Daily Shutdown Routine自动完成。

7.1.10　实验结束后,加样槽中加入10%或者20%的自制漂白液清洁系统,Maintenance界面下点击Sanitize。

7.1.11　在对应孔板或加样槽中加入去离子水,Maintenance界面下点击Wash,清洗系统2次。

7.1.12　在对应孔板或加样槽中加入去离子水,Maintenance界面下点击Soak,浸泡探针。

7.1.13　退出软件,关闭系统。

7.2　每周维护

7.2.1　仪器检查

打开Luminex 200 Analyzer的中门和左门,观察是否有漏液,腐蚀,和其他不正常的现象;检测所有的管道连接;检查Luminex XYP仪器的进气滤器是否积累灰尘;检查SD系统和连接是否漏液。如果观察到漏液,关闭系统并联系Millipore公司。

7.2.2　自我诊断在Maintenance界面,点击“Self Test”,系统会进行自我诊断测试;自我诊断结果会显示在Diagnostic界面;系统自我诊断时会关闭激光,所以诊断完成后需要再次预热机器。

7.2.3　清洁探针

打开探针的防护盖;旋松探针的螺丝;探针向上推,从样本臂上取出;用10 mL的注射器或者超声水浴清洁探针。如果使用超声水浴,将探针置于超声水浴底部2～5 min。如果用注射器,用蒸馏水从底部冲洗探针;安装好探针,并调整好高度。每次移动探针后都要重新调整探针高度;在加样槽中加入70%异丙醇或者70%乙醇,Maintenance界面运行“Alcohol Flush”操作。

7.2.4　冲洗系统

Maintenance界面运行3次Back Flush;Maintenance界面运行3次drain;在加样槽中加入70%乙醇或70%异丙醇,Maintenance界面运行2次Alcohol Flush;在加样槽或者96孔板中加入蒸馏水,Maintenance界面运行运行wash 3次。

8.使用中的注意事项及常见故障的排除

8.1　压力：压缩机运转时,正常气压和鞘液压力读数在6至9 psi之间。如果系统压力超出了此范围,标本获取可能会失败或产生错误结果,见表3-15。

表3-15　压力故障及解决方案

8.2　液体泄漏：液体泄漏可能导致压力不足和标本获取失败,见表3-16。

表3-16　液体泄漏故障及解决方案

8.3　标本获取故障见,表3-17。

表3-17　标本获取故障及解决方案

8.4　校准和控制故障,见表3-18。

表3-18　校准和控制故障解决方案

续　表

8.5　标本探测装置：标本探测装置故障可能导致液体泄漏及压力故障,并妨碍标本获取,见表3-19。

表3-19　标本探测装置故障解决方案

8.6　Luminex SD故障：如果未更换清空的鞘液,见表3-20。

表3-20　Luminex SD故障解决方案

9.设备图片

图3-22　Luminex　200流氏点阵分析仪。