细菌毒素的检测和血清学鉴定简介

(一)细菌毒素概述

细菌的毒素按其来源、性质和毒性作用的不同,可分为外毒素和内毒素两种。

1.外毒素是某些细菌在生长繁殖过程中分泌到菌体外的一种代谢产物,主要成分为蛋白质。

2.内毒素是许多革兰阴性菌(如沙门氏菌、志贺氏菌、脑膜炎球菌等)的细胞壁结构成分,生活状态时不释放到外环境中,只有当菌体死亡破裂或用人工方法裂解细菌才释放,故称为内毒素,主要成分是脂多糖。

3.重要的内毒素及其特点

(1)外毒素(exotoxin)：有些细菌在其生命活动过程中产生毒素能释放到周围环境中,称为外毒素。产生外毒素的细菌主要是革兰阳性菌。如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰阴性菌,如痢疾杆菌、霍乱弧菌等。细菌外毒素有以下特点：

1)毒性强,如纯化肉毒杆菌外毒素结晶1mg可杀死2000万只小白鼠,对人的最小致死量为10-4 mg,破伤风毒素对小白鼠的致死量为10-6 mg,白喉毒素对豚鼠的致死量为10-3 mg。

2)对机体组织有选择性的毒素,如白喉杆菌外毒素主要抑制蛋白质合成,特别是影响肽链延长,引发心肌炎、肾上腺出血及神经麻痹等;破伤风外毒素主要毒害脊髓前角运动神经细胞,引起所属肌肉的痉挛强直。

3)具有抗原性,外毒素的化学成分为蛋白质,有抗原性,即以外毒素刺激机体可产生大量的抗毒素,抗毒素能中和外毒素使其无毒。外毒素用甲醛处理后,脱毒变成类毒素,但仍保持抗原性。

(2)内毒素(endotoxin)：是革兰阴性菌的细胞壁成分,细菌在生活状态时不释放出来,只有当细菌死亡自溶或黏附在其他细胞上时,才表现其毒性。内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。

内毒素的致病作用无特异性,即各种革兰阴性菌对人类引起基本相同的反应。少量内毒素可引起机体发热反应;大量内毒素进入血液,可使血管透性改变,局部出血,颗粒性白细胞增多或减少和体重下降,严重时能导致内毒素性休克。内毒素毒性比外毒素小得多。

内毒素是外源性致热源,它可能激活中性粒细胞等,使之释放出一种内源性热原质,作用于体温调节中枢引起发热。

(3)外毒素与内毒素基本特性区别及性质比较分别见表3-10、3-11。

表3-10　内毒素与外毒素的区别

表3-11　细菌外毒素与内毒素性质的比较

(二)细菌毒素检测

1.外毒素

外毒素来源于革兰阳性菌与部分革兰阴性菌,从活菌中分泌出来,少数由菌崩解后释出,化学成分主要是蛋白质,60℃～80℃,30 min可被破坏,抗原性很强,可刺激机体产生抗毒素,对组织器官有选择性毒害作用。

细菌外毒素的检测,通常以细菌外毒素的特异性免疫血清为抗体与被检细菌培养物滤液(抗原)进行抗原-抗体反应来检测外毒素。也可用已知纯化的细菌外毒素为抗原与被检患者血清进行抗原-抗体反应,检测患者所感染的细菌是否产生该种外毒素。此外,也有用动物试验进行检测的(如破伤风梭菌产生的破伤风痉挛毒素可致小白鼠尾部僵直竖起,后肢痉挛强直,甚至全身痉挛而死亡)。

(1)白喉外毒素(diphtheria exotoxin)

1)体外法：通常使用Elek平板毒力试验、SPA协同凝集试验、对流免疫电泳法。

2)体内法：根据白喉外毒素可造成敏感动物豚鼠死亡,如体内含有一定量的抗毒素,则外毒素可被中和,而动物免于死亡。

(2)肉毒毒素(botulinic toxin)肉毒梭菌可产生强烈的外毒素-肉毒毒素,人误食该毒素污染的各种食物,即可发生肉毒中毒,出现特殊的神经中毒症状,有较高的死亡率。被检样本为可疑剩余食物、呕吐物、胃肠冲洗液、粪便浸液、血清及庖肉培养液等。

1)定性试验：取待检物上清液分别用0.5 mL腹腔接种于两只小白鼠,其中一只在接种前注射肉毒毒素的多价抗毒素血清作为保护试验。接种后数小时,未注射多价抗毒素血清者即可出现早期症状：呼吸困难、两侧腰肌明显凹陷,接着出现无力、麻痹、四肢肿胀,一般在18～24 h死亡。保护实验动物则无上述症状而存活。

2)毒素型别鉴定：常选用分型血清作中和试验和反向间接血凝试验,也可用免疫荧光法。

(3)肠毒素(enterotoxin)是某些大肠杆菌在生长繁殖过程中释放出来的外毒素,根据其对热稳定性不同,分为耐热肠毒素和不耐热肠毒素两种。

1)不耐热肠毒素：对热不稳定,经65℃,30 min即失去活性,由A、B两个亚单位组成,A亚单位分为A1和A2,其中A1是毒素的活性部位。LT的B单位受体为肠黏膜上皮细胞表面GM1神经节苷脂。可采用肠段结扎法、皮肤毛细血管通透性亢进试验、中国地鼠卵巢细胞(CHO)及Y-肾上腺细胞(Y-adrenal)的形态变化测定法、被动免疫溶血反应测定法、酶标法、琼脂扩散法(Elek法)等进行检测。

2)耐热肠毒素：对热稳定,100℃,20 min仍不破坏,分子量较小,免疫原性弱,可通过激活肠黏膜细胞上的鸟苷酸环化酶,使胞内cGMP增加,导致体液平衡紊乱而致泻。耐热肠毒素的检测常采用乳鼠灌胃法。

2.内毒素

内毒素是革兰阴性菌细胞壁中的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)组分,只有当细菌死亡破裂或用人工方法裂解菌体后才释放。160℃,2～4 h才被破坏。抗原性弱,对组织无选择性作用,毒性较弱且广泛。现简介几种细菌内毒素检测方法。

(1)家兔热原试验(Rabbit pyrogen test,RT)通过耳缘静脉注入家兔体内,观察家兔注射后的体温变化,以决定所检样本中有无热源存在。RT是一种经典的定性检测内毒素的方法。

(2)鲎试验(Limulus test,LT)

1)原理：鲎是一种海洋节肢动物,其血液中含有一种独特的有核变形红细胞。这种变形细胞的裂解物可与微量的细菌内毒素发出凝胶反应。这是由于鲎红细胞裂解物中的一种凝固酶被细菌内毒素中的脂多糖激活,使其蛋白形成凝胶。因此,可利用此种反应定量或半定量检测细菌内毒素。本试验具有快速、简便、灵敏等优点。

2)材料：①鲎试剂;②标准内毒素;③1.0 mL吸管;④灭菌蒸馏水。

3)方法：　半定量测定(凝胶法)：凝胶法是各国药典细菌内毒素的检测首选方法。它是根据鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理,终点判断采用翻转180度的目测法;②定量测定：随着鲎试验方法测定仪器的不断完善,内毒素测定已向微量定量方向发展。定量测定在常规药品检查、生产过程质控、各种除热源方法的评价、特殊样本的检查(如血液、尿液、脑脊液)等方面,与凝集法相比具有灵敏、快捷、准确的特点。

(3)免疫学方法有关免疫学方法的报道,有酶联免疫吸附检测法(LAL-ELISA)、火箭免疫电泳鲎试验法(TAL-RIE)、L-聚赖氨酸ELISA法、双抗原夹心ELISA法等。这些方法的特点是特异性、准确性高,但其应用尚待临床实践的验证,操作尚待进一步简化。

(4)血液标本的检测

1)预处理

在细菌感染的患者血液中,内毒素可能吸附于血浆及血小板上,同时存在一些阻碍血浆凝固的物质,因此在试验前应对血液标本进行预处理。方法：①氯仿法：血液1000 r/min离心10 min,上层血浆中含大量血小板。取血浆1 mL,加入0.25 mL氯仿,猛烈振荡60 min,分出三层,取中间层作为试样。②乙醚法：在上述1 mL血浆中加1mL冷乙醚,振摇数分钟,56℃、30 min或60℃、5 min,去除乙醚,3000 r/min离心10 min,取上清液作试样。

2)凝固反应方法

在小试管内加入鲎试剂0.1～0.2 mL,加入等量的经预处理的血液试样,轻轻摇匀,37℃垂直放置1 h,观察凝固反应程度。同时设阳性对照和阴性对照。

3)观察结果

在阳性对照和阴性对照结果正确的情况下判断实验结果。倾斜试管45°,血液不变形,完全凝固为强阳性(+++);血液呈现变形而不流动的凝固状为较强阳性(++);血液部分凝固、部分流动的半流动状态为阳性(+);血液完全没有变化为阴性(-)。

4)注意事项

①当凝固反应肉眼观察有困难时,可按照下列方法观察,取预处理的含大量血小板的血浆一滴,向鲎试剂溶液缓缓滴下,细胞迅速沉降者,反应为阴性(-);血细胞不完全沉降,凝固状分为两层,反应为阳性(++～+++);血细胞经过一段时间才沉降,反应为(±～+)。该方法容易判断,且误差较小。

②操作所用的小试管等器具必须确保清洁,未污染其他内毒素。

③反应温度严格控制在36℃以下,超过40℃反应被抑制反应时间与内毒素量有关系,一般1 h内,反应随内毒素含量的变化可增加或减少数倍,若延长到4 h以上,则认为无效。

④若将试样加以稀释,也可进行定量测定。目前多用肉眼观察,也存在一定的操作误差,为此,有人应用比浊法、微量涂片法和凝固蛋白质测定法进行试验。目前还有一种溶解物酰胺酶活性测定法,这是根据糖变形红细胞溶解物所含有的酰胺酶在细菌内毒素活化下能专一地水解α-N-笨甲酰-Ⅱe-卜谷氨酸-精氨酸-对硝基苯胺(βⅠ-Ⅱe-Glu-Gly-Arg-P-nitro-anilide),酶活性随内毒素含量的增加而增加,故可正确观察和测定细菌内毒素。

尿液,唾液,脑脊液标本对凝固反应物抑制作用,不经预处理,直接按上述步骤进行试验,观察其所含的内毒素。在测定尿液内毒素时,要求菌量不少于104个细胞/mL,否则可能出现阴性。

(5)生物学方法

利用内毒素刺激免疫细胞产生IL-1、TNF的特性,以标化的细胞系作为靶细胞,检测细胞培养上清液中的IL-1、TNF等细胞因子含量,推算出待检样本中的内毒素含量。

(6)化学发光法

应用CR1和CR3受体诱导中性粒细胞的氧化反应作为一个反应平台,通过测定内毒素对中性粒细胞的生物学作用来检测内毒素的含量。

(7)流式细胞术

应用针对内毒素表面抗原决定簇的单克隆抗体对内毒素进行荧光标定而后应用流式细胞仪进行检测。本方法不同于其他方法之处在于它所测定的是内毒素的量而不是活性。

(8)高效液相色谱

将内毒素中类脂A部分衍生化后,以高效液相色谱法检测。

(9)临床意义

1)革兰阴性菌脑膜炎的诊断：本试验在鉴别革兰阴性菌脑膜炎方面效果令人满意。本试验对革兰阴性菌脑膜炎的专一性很高,在早期诊断方面颇有价值,尤其对小儿患者更为适宜,儿童、特别是新生儿的败血症与脑膜炎多数为大肠埃希菌等革兰阴性菌和乙型溶血性链球菌所引起,早期确定感染病原类型,对选择适当抗生素及早期治疗很有益处。

2)革兰阴性菌败血症的诊断：本试验对革兰阴性菌败血症的观察也十分灵敏。Levin等试验证明,本试验的阳性结果与革兰阴性菌的感染是一致的,且能迅速、正确地鉴别出败血症病原菌的类型。

3)革兰阴性菌尿路感染的诊断：本试验还应用于尿路感染检查。

由上可见,本试验对革兰阴性菌产生的内毒素具有高度特异性,而对革兰阴性菌内毒素以外的物质无明显的凝固作用。阳性菌、酵母和病毒的毒素比阴性菌内毒素的活性低1%以下,故在通常情况下,它们在本实验中均为阴性。鲎试验灵敏度高,可检查出0.005～0.0005μg/mL内毒素。目前在细菌学检验中,常规的培养方法,需要数天才能出结果,在未出结果之前往往滥用抗生素,影响治疗,耽误病情,甚至抢救不当,导致死亡。若使用本试验,操作简便,速度快,2 h内即可得出结论,判明病原菌类型,有利于合理用药和早期治疗,因此本试验值得在临床检验中使用。

3.肠毒素检测

(1)不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin,LT)

1)肠段结扎法(www.xing528.com)

原理：将LT注入结扎肠段,LT进入肠上皮细胞内激活腺苷环化酶,使ATP合成cAMP,使cAMP上升,导致水分与电解质通过小肠上皮细胞大量损失,可见肠内充满液体。

材料：　实验动物：体重为2 kg左右的健康家兔(10周龄左右);手术器械：实验动物手术固定台,无菌的手术器械(如手术刀、镊、钳、剪、缝合针、线等);药品：麻醉动物用的乙醚、消毒用的酒精棉球、碘酊棉球;细菌培养上清液：待检菌培养上清液;阳性对照菌培养上清液(7922或7910菌);阴性对照菌培养上清液(E.coli K-12 W1485)。

实验方法：取10周龄健康家兔一只(2 kg左右),禁食2天后固定于实验动物手术台上;用乙醚麻醉(吸入法)后,以无菌操作的方法剖腹取出小肠,自回盲末端开始结扎肠段6个(每10～12cm);其中一段作阳性对照(注入7922或7910菌培养上清液2mL),一段作阴性对照(注入E.coli K-12 W1485培养上清液2mL),其余四段注入待检菌培养上清液2 mL;注射完毕后,将小肠送回腹腔内,连续缝合,用无菌纱布包扎手术部位,18～24 h后观察结果。

观察结果：阴性对照肠段未见肠内有液体,阳性对照段肠内充满液体(可达到1mL/cm3)。实验组以液体潴留量与肠段长度之比(W/L)作为毒素活力指标。

2)皮肤毛细血管通透性亢进试验：

原理：将LT注射实验动物皮内,LT可激活皮肤毛细血管活性物质(5-羟色胺、激肽释放酶与激肽)的释放,使毛细血管扩张、通透性增加。静脉注射色素,色素可通过通透性增高的毛细直管壁渗出,致使皮肤出现蓝色的色斑。

材料：实验动物家兔或豚鼠一只;剃毛用剪刀,酒精,碘酊;镊子、无菌注射器等;待检菌培养上清液;亚甲蓝乙醇饱和溶液(95%乙醇50mL亚甲蓝1 g)。

实验方法：　将家兔背部或豚鼠腹部剃毛后,碘酊、酒精消毒;皮内注射待检菌培养上清液0.1 mL;24 h后,家兔耳静脉(豚鼠股静脉)注射亚甲蓝乙醇饱和溶液1 mL。

观察结果：注射色素后注意家兔背部(豚鼠腹部)蓝色斑的出现及直径大小。蓝色斑直径越大说明待检菌上清液中含LT越高,毒力越强。

3)中国仓鼠卵巢细胞(CHO)及Y-肾上腺细胞(Y-adrenal)的形态变化测定法：LT进入细胞内可激活腺苷环化酶,使ATP合成cAMP,结果使细胞内cAMP含量增加,从而可使CHO细胞形态由椭圆形变成梭形;可使Y1-肾上腺细胞则由梭状变成椭圆形。在显微镜下至少观察200个细胞,算出比率,作为毒素活性指标。

4)被动免疫溶血反应测定法：原理：LT可与绵羊红细胞表面的GM1神经节苷脂特异性结合,当加入抗霍乱肠毒素IgG抗体后,LT与其发生特异性结合,而被致敏的绵羊红细胞在加入补体后发生溶血,以420 nm的波长测定其吸光度,从而测出LT的含量。

5)酶标法(间接法)：GM1神经节苷脂包被塑料板,加入待检测标本(阳性对照：大肠埃希菌培养上清液),然后加入豚鼠抗霍乱肠毒素血清,再加入羊抗豚鼠IgG的酶标记物,最后加底物显色。

6)琼脂扩散法(Elek法)：将分纯并鉴定为大肠埃希菌的菌种接种于Elek琼脂平板上,并涂布呈椭圆形;35℃培养48 h,用20000 u/mL多黏菌素浸沾后的纸片贴在菌落上;35℃,5～6 h，于中心距菌苔4～5 cm处打一个直径约为4 mm的孔,加入已提纯并以稀释的LT抗血清20～30μL;在各菌苔外缘挑取7 mm直径的琼脂块四个,浸入0.5 mL,pH7.0,0.01mol/L PBS中,放冰箱过夜用于测定ST。然后将平板置35℃培养15～20 h观察结果;观察结果：凡与LT抗血清产生沉淀线的试验菌为LT阳性。

除上述方法外,还可用ELISA法、基因探针法、同位素免疫分析法等测定LT。

(2)耐热肠菌素(heat-stable enterotoxin,ST)-乳鼠灌胃法

实验方法：用安装塑料管的注射器给1～4 d龄乳鼠(瑞士种)灌入0.1 mL标本,标本中加入20 g/L尹文蓝(作为是否正确灌入胃内的指标)。灌入标本后勿喂奶,室温3～4 h后,用氯仿处死,取出全部肠管,计算有液体潴留的全肠与摘出肠道的其余体重。

观察结果：计算肠道/体重的重量比。若二者比率为0.09或以上者为阳性;0.07～0.08为可疑;ST作用在3 h前后为最强,以后体液逐渐减少,17 h后为阴性。

(三)血清学鉴定技术

血清学试验是根据相应的抗原和抗体在适宜条件下,能在体外发生特异性结合得原理,用已知的抗体或抗原来检测未知抗原和抗体。用含有已知特异性抗体的免疫血清与从样本中分离培养出的未知纯种细菌进行血清学试验,以确定致病菌的种或型。这种血清学试验称为血清学鉴定,常用的方法有凝集反应、免疫荧光技术、酶免疫测定等。

1.凝集反应

(1)玻片法凝集试验

用含已知抗体的诊断血清,在玻片上直接与细菌培养物或菌悬液混合,若有与抗体相应的细菌,则出现肉眼可见的凝集块或颗粒。

试验在载玻片上进行,取诊断血清和生理盐水(对照用)置载玻片两端,再取待检菌少许,分别与诊断血清和生理盐水混匀。反复转动玻片,1～3 min后即可观察结果。对照一侧均匀浑浊,试验一侧明显凝集,即为阳性。

该试验简单易行且特异性强,主要用于鉴定菌种及分型。如沙门氏菌属、志贺氏菌属、布鲁菌属、致病性大肠埃希菌、霍乱弧菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌或抗原、链球菌等细菌的鉴定。

(2)反向间接血凝试验

将已知的抗血清直接吸附或通过化学偶联的方法结合于红细胞表面,制成抗体致敏红细胞,再与被检物混合。若被检物中含有相应的细菌,则发生红细胞凝集现象,以鉴定细菌。试验常在微量滴定板中进行,先将标本进行倍比稀释,同时设不含标本的对照孔,然后于各孔中加人诊断抗体致敏红细胞悬液,置湿盒中37℃温育l h,观察结果。根据红细胞凝集的程度,判断阳性反应的强弱,以出现“2+”以上凝集强度判断为阳性结果。

该试验敏感性较高、反应快速、结果易于观察,常用于脑膜炎奈瑟菌、布鲁菌、霍乱弧菌、炭疽芽孢杆菌及鼠疫耶尔森菌等细菌的快速鉴定。还可用于金黄色葡萄球菌肠毒素、肉毒毒素等细菌毒素的测定。

(3)胶乳凝集试验

将已知的抗血清吸附在聚苯乙烯颗粒上,可与相应抗原产生肉眼可见的胶乳颗粒凝集现象,借以鉴定细菌。

于玻片两端分别加一滴生理盐水,取待检菌少许分别混悬于其中,如无自凝现象则在一端加一滴胶乳试剂,而另一端加一滴空白胶乳试剂作为对照,混匀,连续摇动玻片2～3 min即可观察结果。试验端出现明显凝集块,空白对照均匀浑浊者即为阳性。

胶乳凝集试验敏感度虽然不及反向间接血凝试验,但由于操作简单,反应快速,而被临床广泛应用。

(4)协同凝集试验

金黄色葡萄球菌细胞壁中的A蛋白(SPA),能与人和多种哺乳动物抗血清中IgG类抗体的Fc段结合,使Fab段暴露于葡萄球菌的表面,而且仍保留其正常的抗体活性和特异性。当金黄色葡萄球菌与已知的IgG抗体连接时,则成为抗体致敏的颗粒载体,与相应细菌或抗原接触时,则出现肉眼可见的凝集现象,借以证明相应细菌或抗原的存在。

将载玻片分成3个格,编号为1、2、3,于1、2格分别加一滴抗体致敏SPA菌诊断液,第3格加一滴未致敏的SPA菌液。然后于1、3格分别加入待检标本,第2格加生理盐水,各自混匀,2～3 min后观察结果。根据金黄色葡萄球菌凝集的程度,判断阳性反应的强弱,第2、3格作为对照,应无凝集,第1格内以出现“2+”以上凝集强度(金黄色葡萄球菌凝集成清晰可见的颗粒,液体澄清)判断为阳性结果。

该方法快速、简便、敏感性高,且结果易于观察,已广泛用于细菌的快速鉴定和分群(型),如链球菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、沙门氏菌、志贺氏菌等的检测。亦用于直接检测传染病早期血液、脑脊液和其他分泌液中可能存在的微量抗原,如取流脑患者的脑脊液,直接检测脑膜炎奈瑟菌,有助于一些传染病的快速诊断。

2.免疫荧光技术

免疫荧光技术是利用免疫学特异性反应与荧光示踪技术相结合的显微镜检查手段。既保持了血清学的高特异性,又极大地提高了检测的敏感性,在细菌鉴定方面占有重要地位。常用的方法有直接法、间接法和免疫荧光菌球法。

(1)直接法

将已知抗血清用化学方法结合荧光色素制成荧光抗体,以此来浸染固定在玻片上的未知细菌,若为相应细菌,则两者发生特异性结合而留在玻片上,不被缓冲液冲掉,在荧光显微镜下有荧光出现,借此鉴定细菌。

将待检标本涂布于玻片上,自然干燥,用甲醇或丙酮固定,加荧光抗体于标本片上,37℃反应30 min,然后用洗涤液冲洗未结合在细菌抗原上的荧光抗体。自然干燥后封片,置荧光显微镜下观察。同时作阳性对照以证明荧光抗体的质量,并作阴性对照证明操作的准确性。当阳性对照荧光强度“2+～4+”,阴性对照为阴性时,待检细菌荧光“2+”以上且细菌形态典型,即为阳性。

该方法简便、快速、特异性强,已广泛应用于临床细菌标本的快速鉴定。如链球菌、脑膜炎奈瑟菌、致病性大肠埃希菌、志贺氏菌、霍乱弧菌、鼠疫耶尔森菌及炭疽芽孢杆菌等细菌的检测。

(2)间接法

荧光抗体与待检细菌不直接结合,而是通过无荧光标记的抗体再与待检细菌结合。即以荧光物质标记抗免疫球蛋白抗体(抗Ig抗体),先使待检标本与已知的抗血清反应,如果标本中有相应细菌,则形成抗原-抗体复合物,可与随后加入的荧光标记抗Ig抗体进一步结合而固定在玻片上,在荧光显微镜下有荧光出现,借以鉴定细菌。

将待检细菌标本涂片,自然干燥,固定。在涂片上加已知的抗血清,置37℃反应30 min,用洗涤液冲洗玻片,干燥后于标本片上滴加荧光标记的抗Ig抗体,置37℃反应30 min,倾去荧光抗体,洗涤,干燥后封片,置荧光显微镜下检查。试验同时设阳性和阴性对照。标本中细菌荧光“2+”以上,即为阳性。

间接法敏感性高于直接法,常用于链球菌、脑膜炎奈瑟菌、致病性大肠埃希菌、志贺氏菌、沙门氏菌等细菌的检测。

(3)免疫荧光菌球法

是荧光抗体直接染色法与增菌培养相结合的一种新型的免疫荧光快速诊断技术。在培养基中加入一定量的荧光抗体,然后接种标本,若标本中有相应的病原菌时,抗体则与之结合而凝集,凝集后的细菌继续繁殖而集合成团,在荧光显微镜下呈现团绒球样荧光,故称荧光菌球。

将已知抗血清用荧光标记制成荧光抗体,取一定量加入液体培养基中。再从中取一大滴于一凹载玻片上,然后加待检标本及其培养物于玻片上与之混匀,置玻片于37℃温箱,9～18 h后取出,加盖玻片,荧光显微镜检查。菌球呈多形态且有黄绿色明亮荧光,即为阳性;无呈黄绿色荧光的菌球,则为阴性。常用以检测肠道中的致病菌,如标本中志贺氏菌的检测。

3.酶联免疫吸附试验(ELISA)

ELISA既可用于病原的检测、抗体检测,还可用于细菌代谢产物的检测,几乎所有可溶性抗原抗体反应系统均可检测,最小可测值达ng甚至pg水平,具有高度的特异性和敏感性。试剂的商品化以及自动化操作仪器的广泛应用,使之成为临床细菌检验中应用最为广泛的免疫学检 测技术。其方法有双抗体夹心法、间接法和竞争法,其中双抗体夹心法和竞争法常用于检测抗原。

(1)双抗体夹心法

将已知抗体包被在聚苯乙烯反应板上,制成固相抗体;加人待检标本,若标本中含有相应细菌抗原时,则二者结合形成抗原一抗体复合物固定在板上,洗涤除去未结合物;再加人该抗原特异的酶标抗体与固相免疫复合物上的抗原结合,洗涤除去未结合物;最后加入该酶的底物显色,根据产物颜色深浅或测定其吸光度值,可进行定性或定量分析。借此检测某种细菌抗原及鉴定菌型。如伤寒患者尿中菌体多糖抗原的测定。

(2)竞争法

将已知的抗体包被在聚苯乙烯反应板上,同时加入被检细菌抗原标本和一定酶标已知抗原(与已知抗体相对应),若标本中含有已知抗体的相应抗原,则两种抗原与固相抗体竞争结合,使酶标抗原与固相载体的结合量减少。加入底物后,颜色越淡,标本中抗原含量越多。该方法既可用于测定细菌抗原,也可用于血清中抗体的检测。

目前,临床上普遍采用成套的ELISA试剂盒进行检测,具体操作方法可按说明书进行,不再赘述。

除以上所述方法外,对流免疫电泳、免疫印迹试验、发光免疫技术等亦可用于临床标本中细菌的鉴定。

(3)胶体金检测

胶体金试剂条诊断是采用胶体金免疫层析技术研制而成的,该技术是90年代初在免疫渗透技术的基础上建立的一种快捷简单的免疫学检测技术。

胶体金是氯金酸HAuCl4的水溶胶,氯金酸在还原剂的作用下,聚合成特定大小的金颗粒,并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。质量好的胶体金溶液是红色的,胶体金颗粒为球形,大小均一,无棱角。质量差的溶液是紫色,大小不一,形状各异。

原理：胶体金在碱性条件下带负电荷,与蛋白质分子的正电荷基团产生静电吸引,从而牢固结合。以硝酸纤维素膜为载体,利用了微孔膜的毛细血管作用,滴加在膜条异端的液体慢慢向另一端渗移,通过抗原抗体结合,并利用胶体金呈现颜色(红色)反应,检测抗原/抗体。最常用的是双抗夹心法检测抗原。

(四)细菌毒素检测及血清学鉴定的应用和发展

毒素是细菌的主要致病因子,致病力强,对人畜健康危害甚大,无论人医、兽医、不管是在防疫还是医疗方面都日益受到重视。近些年来毒素型食物中毒事件时有发生,毒素研究工作在全世界逐步展开,获得了巨大发展,特别是和平年代以来发展更快,被称为毒素研究的新世纪,研究工作的深度日益增加。生化、免疫、遗传等最新技术都应用于毒素的研究,因此毒素研究已成了分子生物学一个极活跃的领域。

血清学鉴定广泛应用于生物活性物质得超微定量、物种及微生物鉴定和分型等方面;也用于基因分离,克隆选择,表达产物的定性、定量分析和纯化等,已经成为现代分子生物学研究的重要手段。微生物的实验室中,常用已知的病原微生物,以检查病原微生物感染者的血清中有无相应的抗体,或用含有已知抗体的特异免疫血清来鉴定未知的微生物。

(五)细菌毒素检测及血清学鉴定仪器的选择

免疫标记技术是今年来研究毒素检测及血清学反应的一项新技术。它不仅可以用于抗原抗体的定性、定量,还可用于抗原抗体的定位。由于其反应的特异性敏感性高,不但在诊断疾病时广为应用,亦可用于生物领域其他方面。ELISA与其他技术相比,具有灵敏度高,特异性强,仪器设备要求不高,测定成本低,方法快速、简便,试剂保存时间较长,自动化程度高,无放射性同位素污染等优势;但同时也存在局限性,比如不能同时分析多种成分,对试剂的选择性高,对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应。所以未来的发展趋势就在于开发高度免疫原性的重组抗原,研究多项标记快速测定方法,将酶体外定向进化应用到检测中以及研发种类更多的全自动酶联免疫测定仪。这样将扩大检测的范围,提高检测的稳定性,加强标准化,同时也促进了商品化的应用。

目前,食源性致病菌监测网常用的有关细菌毒素检测及血清学鉴定仪器有：法国梅里埃mini VIDAS,美国Luminex Corporatin公司的Luminex 200,其中mini VIDAS将即可用试剂条插入仪器中,系统自动进行整过免疫分析的预温、吸样、量度、分析及打印结果等不同步骤,可同时进行12或30个不同的测试,仪器拥有两个独立的反应仓,各含6个试验通道,两或五个仓独立运作并可分开启动,仪器最少可同时进行2或5个参数分析,反应仓上装备指示灯说明测试过程进行中/完结,结果报告时间由30 min到2 h(视乎测试参数);Luminex200中Luminex XYP仪器,从96孔微量滴定盘中获得分析标本,并将其注入试管底部。然后,标本以减缓的速度随鞘液一起流动,形成狭窄的标本核心,以确保每一粒微球都能被分别照亮。标本的注射速度应使xMAP微球以一系列单独对象的形式进入光学通道。Luminex SD系统使您无须重注鞘液瓶,即可连续分析标本。它能从未加压的散装鞘液容器中自动吸取鞘液,以确保储液器中始终保持一定量的加压鞘液。一个20公升鞘液容器中的鞘液,即能够满足48 h甚至更多时间的正常操作需求。可根据实验室的实验条件以及实验要求选择适合本实验室的设备使用。