细菌生化药敏自动鉴定系统详解

时间：2023-06-30 理论教育版权反馈

【摘要】：一些自动化程度高,功能齐全的鉴定和药敏系统相继出现,并适用于微生物检验、卫生防疫和商检系统。本节主要介绍微生物检测系统中生化鉴定以及药敏鉴定的自动化鉴定系统。(一)细菌生化、药敏自动鉴定系统在食品微生物鉴定中的应用在食源性致病菌传统的生化鉴定中主要依据是化学反应、血清学反应等。(二)细菌生化自动鉴定系统近年来,微生物的检测鉴定技术已逐步由手工检测走向仪器化和电脑化,并力求简便、快速、准确。

细菌生化药敏自动鉴定系统详解

长期以来,微生物检验均是以手工操作为主,自行配制各种培养基和试剂,其结果的可行性很差,操作人员的个人经验和责任心对结果的影响很大。如何快速、准确地鉴定微生物,一直是临床微生物工作者努力目标。一般微生物鉴定首先要进行革兰氏染色,区分是革兰阴性菌还是阳性菌,革兰阴性杆菌进一步做氧化酶试验,革兰阳性球菌做触酶试验和凝固酶试验,最后再按不同类型进行生物化学和血清学鉴定。20世纪60年代发展起来的细菌鉴定方法主要是利用手工配制的试管(单项反应)培养基测定细菌的生化反应,以达到鉴定细菌种属的目的。70年代后微生物学家和工程技术人员密切合作,对微生物的研究采用了物理和化学的分析方法,并根据细菌不同的生物学性状和代谢产物的差异,逐步发展了微量快速培养基和微量生化反应系统,具有简易化、微量化、系统化、商品化和标准化等优点,并实现了从生化模式到数字化模式的转化。由于计算机的广泛应用,大大促进了微生物检验的自动化过程。一些自动化程度高,功能齐全的鉴定和药敏系统相继出现,并适用于微生物检验、卫生防疫和商检系统。功能范围包括细菌、厌氧菌真菌鉴定以及抗生素敏感试验和最低抑菌浓度(MIC)的测定。同时,通过定期发出统计报告,能够为食品安全风险评估提供科学依据。本节主要介绍微生物检测系统中生化鉴定以及药敏鉴定的自动化鉴定系统。

(一)细菌生化、药敏自动鉴定系统在食品微生物鉴定中的应用

在食源性致病菌传统的生化鉴定中主要依据是化学反应、血清学反应等。在鉴定时,我们把这些依据作为鉴定项目进行一系列的观察和鉴定工作。然而根据细菌生物学性状和代谢产物的差异,发展了微量快速和生化反应系统,具有简易化、微量化、系统化、商品化和标准化等优点,并实现了从生化模式到数字模式的转化。形成自动化微生物分析系统。

当前病原菌是以条件致病菌、耐药菌为主,种类更为广泛,包括需氧菌、苛氧菌、厌氧菌、分枝杆菌和真菌等。耐药性不断增强,出现了耐多重抗生素的细菌。

理想的微生物鉴定和药敏分析系统应符合以下要求：

1.快速,鉴定和药敏试验最好能在2～8 h内完成。

2.检测准确率高,能检测一般常规所有细菌,特别是葡萄球菌,非发酵菌和链球菌等需提高检测的准确率和分辨率。

3.自动化和电脑的智能化程度更强,包括条形码识别功能,专家系统和便于网络化的数据分析和储存系统。

4.成本更低,使小型医院都能应用。

(二)细菌生化自动鉴定系统

近年来,微生物的检测鉴定技术已逐步由手工检测走向仪器化和电脑化,并力求简便、快速、准确。结果应用全自动微生物分析系统进行病原菌鉴定时间平均为4～6 h,比传统方法鉴定时间缩短，并能自动打印鉴定结果报告,两种方法的鉴定符合率为100%,准确性、可靠性和自动化程度优于传统鉴定方法。结论全自动微生物分析系统具有操作简便、鉴定快速、准确可靠、高度自动化等特点,是一种鉴定致病菌的较好方法。

1.原理

微生物数码分类鉴定技术集数学、电子、信息及自动化分析技术于一体,采用标准化、商品化和配套的生化反应试剂条(板),可将细菌鉴定到属和种,并可对不同来源的临床标本进行针对性鉴定。如辅以读数仪和电脑分析软件,便可形成半自动化或自动化微生物分析系统。

数码鉴定的基本原理是计算并比较数据库内每一个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和。

(1)数据库被已知临床相关菌株构建,它由许多细菌条目(taxa)组成。每个条目代表一个细菌种或已给细菌生物型。有些细菌单靠生化反应无法将属内细菌鉴定到种,条目代表细菌属并提出“需要血清学试验”等进一步鉴定的指示。每个条目包括多种单项生化反应。系统中各种种类有各自相应的数据库,可鉴定出不同数目的细菌。鉴定即通过十几条中的生化试验将一种(组)细菌与其他细菌相互鉴别,并用鉴定百分率(%id)表示每种菌的可能性。

(2)编码即将所得到的细菌生化反应模式转换成数学模式,可把被测细菌的全部生化反应结果快速转录成数字(编码),经查阅编码检索本或电脑分析系统又可将数字转化成相应的细菌名称。

编码的原则是将所有生化反应的阴阳性结果而得出的以+或-为标志的信息编为一组数字。具体做法是：将全部反应每3个归为一组,每个组的第1个反应阳性时记作1,第2个反应阳性时记作2,第3个反应阳性时记作3,各种反应阴性时记作0。将每组3个反应得出的3个数字相加,结果可能为0～7之间的任何一个数字。

在有些情况下,7为数码还不足以分辨,这既是要做一些补充试验,包括以下试验：①硝酸盐还原成亚硝酸盐(NO3→NO2);②亚硝酸盐还原成氮气(NO2→N2);③动力(MOB);④麦康凯琼脂上生长(MAC);⑤葡萄糖氧化(OF-O);⑥葡萄糖发酵(OF-F)。

(3)查码在编码检索本内寻找数码谱,有两种可能性：

1)有此数码,并写有以下信息：

①有一个或几个菌名条目及其%id值和T值;

②对鉴定结果好坏的评价：“最佳、很好、好、可以接受、不可接受等”;

③用小括号指出关键的生化结果,并列出该项反应应得的阳性百分率;

④遇到分辨不清或多条菌名列在一起时,指出必须增加补充试验的项目及该反应应得的阳性百分率;

⑤指出某些注意点,如推测性鉴定,“需用血清学鉴定进一步证实”等。

2)无此数码,可能有以下几种原因：

①此生化谱太不典型;

②不能接受,%id<80.0;

③可疑,测试菌对某一生化反应出现阳性,而相似菌对该反应的阳性百分率为0;

④菌种不纯。

(4)解释

1)如果排序第一的细菌%id≥80.0,则可将未知菌鉴定在此条目中,并按%id值的大小对鉴定的可信度做出评价;%id≥99.9和T≥0.75为最佳鉴定;%id在99.0～99.8之间,T≥0.5为很好的鉴定;%id在90.0～98.9之间,T≥0.25为好的鉴定;%id在80.0～89.9之间为可以接受的鉴定。

2)如果第一条目的%id<80.0，就将前2个条目的%id加在一起;若还不足80.0,则将前3个条目%id加在一起。若前3个条目%id的和≥80.0,就有两种可能：鉴定到种水平,必须是加在一起的条目是同一细菌内不同生物型;“鉴定到属水平”,必须是加在一起的条目是统一细菌属内不同种。上述两种情况的鉴定的可信度评价即根据相加后的%id大小评价。

如果相加的几个条目既不属于同一细菌种,又不属于同一细菌属,在评价中会指出需要“补充生化反应”的项目及阳性反应率,可通过这些生化反应将几项菌区分开来。如果头3个条目的和<80.0,则此结果被认为是不可接受的。

2.数码分类鉴定系统组成和操作

(1)数码分类鉴定系统的组成由试剂条、添加试剂及检索工具配套形成的完整的微生物鉴定体系。

1)试剂条常用的生化反应有：①发酵试验;②同化试验;③同化或发酵抑制试验;④酶试验;⑤其他传统的生化反应。

2)添加试剂：有些试验经孵育后需添加试剂才能呈现颜色变化。添加的试剂有配套试剂盒或单种试剂。

3)检索工具：检索工具包括鉴定表、编码本和电脑软件,可供人工查阅鉴定结果或由电脑自动处理并报告。每盒试剂条中均附有操作说明书,包括鉴定百分率表。编码本按品种不同分为若干本,与相应的鉴定试剂条配套,如API(肠杆菌科)等。电脑分析软件包括API LAB plus和ATB plus。

(2)操作要点

1)准备

①标本经分离培养得到纯菌落。

②借助涂片、染色镜检、氧化酶等试验对被测菌进行初步鉴定,以选择合适的试剂条。

③挑选被测菌的纯菌落接种试剂条。

2)接种

①制备细菌悬液：挑取菌落按试条要求用生理盐水制备菌悬液。

②调整菌悬液浓度：按试条要求调整至1.5亿/mL(0.5麦氏单位)。

③接种的体积：注意接种后液面要平,不凸起也不凹陷,否则将影响观察结果。

3)观察及记录结果：接种后的试条经35℃～37℃孵育18 h观察结果,并在报告单上记录结果。

4)结果的解释

解释的依据是鉴定百分率表、编码本和电脑软件,可将反应结果直接与百分率表核对而得出结果,或将生化反应的结果按3个一组得出数码,查阅编码本即可得出解释。与电脑联机,可半自动地得到鉴定的结果。

3.基本结构与性能

采用数码分类鉴定法的原理。全自动微生物鉴定仪的主要结构有读数仪/孵箱、计算机、终端、键盘和打印机等,有的仪器有充液/封口部件。半自动微生物鉴定仪的主要结构有读数仪、计算机、终端、键盘和打印机等。

(三)细菌药敏自动鉴定系统

目前常用的有微量稀释法试验系统和纸片扩散法阅读系统。

目前应用最多的,根据操作的自动化程度分为三种。

(1)计算机辅助手工系统：用手工装置判读结果(光笔式或触笔式模板),并用计算机参与记录数据、解释结果和打印报告及贮存和恢复数据。

(2)半自动系统：需在系统外孵育,孵育后用专用光度计或浊度计自动检测和分析细菌生长终点。

(3)全自动系统：孵育与检测一体化,在孵育的同时光度计、浊度计或荧光光度计自动检测细菌生长终点和速率。所有仪器由数据处理器控制、贮存、分析数据,专用电脑打印报告等。

基于肉汤稀释法的自动化抗菌药物敏感性试验系统常采用比浊法检测液体培养基中细菌生长,或者检测特殊培养基中荧光基质的水解作用。在抗菌药物存在的情况下,浊度降低时细菌生长受抗菌药物抑制的表现,而浊度增加表明细菌耐药。为了在3～5 h内提供药物敏感性试验结果,需对常规药物敏感试验方法进行改良,如提高接种物中细菌浓度;使用非传统生长培养基,可加快细菌生长速度或利于细菌耐药监测;通过不同抗菌药物浓度下细菌生长率与标准微量肉汤稀释法的结果比较,计算出最小抑菌浓度。

近年来,以荧光底物水解为基础的确定细菌对抗药物耐药性的药敏试验系统,加快了药敏试验的速度,缩短了试验报告的时间。从自动化药敏试验系统的结果判读来看,理论上荧光技术比光度技术更灵敏,可更快评价微生物的生长状况。但是,荧光技术检测是间接的,其检测前提是假设所有细菌都能代谢荧光底物且非繁殖细菌的酶活性可以忽略,并且假设荧光底物不干扰所有被检测抗菌药物的活性。

评价微生物自动化抗菌药物敏感性试验系统主要指标为合适的准确度、能解释最小抑菌浓度结果。然而,当出现云雾状浑浊或片状沉淀物时,可能被自动化阅读仪遗漏,导致不正确结果。

(四)不同细菌生化、药敏自动鉴定系统的选择

随着计算机技术的快速发展,出现了微生物检验自动化系统和微生物自动鉴定药敏仪,只需将致病菌制成纯菌液,放入自动鉴定和药敏仪中,通过计算机自动读数、分析、最后自动报告细菌鉴定和药敏结果。与传统式生化鉴定和手动商品化鉴定相比较,由于其测量速度快、准确性高、消耗试剂量小,现已在各级医院、疾控中心等检验单位得到广泛使用。配合使用可大大提高常规生化检验的效率及收益。

自动鉴定系统以细菌的微量生化反应为基础,不同种类检测卡含有多种的生化反应孔根据试卡各生化反应孔中的生长变化情况,由读数器按光学扫描原理,定时测定各生化介质中指示剂的显色(或浊度反应,然后把读出信息输入电脑储存并进行分析,再和预定的阈值进行比较,判定反应,再通过数值编码技术与数据库中反应文件进行比较,最后鉴定报告将在显示器上自动显示)并在打印机上自动打印。现在国内常用的微生物自动鉴定系统品牌有法国梅里埃,包括VITKE ®2 Compact、ATB Expression、BD公司的PHOENIXTM100、Giles公司的BIOMIC V3。其中VITEK 2 Compact对于绝大多数细菌的鉴定在2～18 h内可得出结果,一次最多可做60份菌株的检测,可以鉴定405种细菌;ATB Expression鉴定的菌种在600以上,其中,肠杆菌科细菌、能快速生长的链球菌和肠球菌及厌氧菌有4 h就能出结果的快速鉴定试剂条。特别是厌氧菌鉴定试剂条,试剂条不用在厌氧环境中,而在普通的孵箱中4 h就能出结果;PHOENIXTM100鉴定实验平均在3～4 h内可完成,90%药物敏感实验在4～6 h内完成,它可同时进行100株菌株的菌型鉴定和药物敏感实验的检测;BIOMIC V3该系统能够通过标准的连续梯度纸片扩散法利用直接回归分析来计算出抗生素的最低抑菌浓度(MIC),提高了读值的一致性、准确性和速度。它的一大特色是具有抑制系数(IQ)功能,有时也称作治疗指数;它可使MIC结果的解释变得简单明了。各实验室可以根据本实验室自身的实验条件及实验需求选择适合的微生物自动鉴定系统。

四、VITKE ® 2 Compact全自动微生物鉴定/药敏分析系统

1.产品厂家及型号

厂家：法国bioMérieux,型号：VITKE ®2 Compact VITKE-15、VITKE-30、VITKE-60全自动微生物鉴定及药敏分析系统。

2.产品特点

操作简单,界面友好,自动化程度高;VITEK 2系统拥有7种鉴定卡片,涵盖厌氧菌、苛养菌、真菌及棒状杆菌等,覆盖的细菌种类全,可鉴定的细菌数量多。

细菌鉴定ID值标准：源于国际细菌鉴定的参考标准API鉴定系统。鉴定准确度达96%～99%拥有快速药敏报告功能,仪器每15 min自动扫描一次,可在试验开始后约3 h陆续把部分已完成的抗生素结果自动报告。总共鉴定/药敏平均5～7 h报告结果。

开发的高级专家系统涵盖有3500种表型,收录了45000个MIC分布,是其他任何厂家都无法比拟的,高级专家系统自动修正结果,保证药敏的准确性,更符合临床疗效。可利用等效推导和表型推导报告更多的抗菌药物结果,适应不同地区的用药习惯。

3.用途

VITEK ®2 Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统集样本制备、孵育和光学检测功能于一身,用于细菌和真菌的鉴定和重要临床细菌抗生素药敏试验。该系统作为全自动细菌鉴定和药敏分析的检测系统,以最少的实验人员及最短的准备和处理时间,提供最准确的测定结果。该系统目前推出了以下几种卡片：a.GN革兰阴性菌;b.GP革兰阳性菌(其中包括猪链球菌的鉴定);c.YST酵母菌;d.ANC厌氧菌;e.NH奈瑟氏菌和嗜血杆菌;f.CBC棒状杆菌;g.革兰阴性菌药敏测试;h.革兰阳性菌药敏测试;f.肺炎链球菌药敏测试。30型最多可同时30个测试(60型可容纳60个测试)

4.工作原理

由生物梅里埃公司出品的全自动微生物鉴定/药敏分析系统VITEK是目前世界上最先进、自动化程度最高的细菌鉴定仪器之一。VITEK已被许多国家定为细菌最终鉴定设备,并获美国药品食品管理局(FDA)认可。该系统有高度的特异性、敏感性和重复性,还具有操作简便、检测速度快的特点,绝大多数细菌的鉴定在2～18 h内可得出结果。

VITEK对细菌的鉴定是以每种细菌的微量生化反应为基础,不同种类的VITEK试卡(检测卡)含有多种的生化反应孔,可达30种。将手工分离的待检菌的纯菌落制成符合一定浊度要求的菌悬液,经充填机将菌悬液注入试卡内,封口后放入读数器/恒温培养箱,根据试卡各生化反应孔中的生长变化情况,由读数器按光学扫描原理,定时测定各生化介质中指示剂的显色(或浊度反应),然后把读出信息输入电脑储存并进行分析,再和预定的阈值进行比较,判定反应,再通过数值编码技术与数据库中反应文件进行比较,最后鉴定报告将在显示器上自动显示)并在打印机上自动打印。

5.VITEK系统的结构组成

5.1　检测卡

目前VITEK系统的检测卡有14种,微生物常用的有7种,即：革兰氏阳性菌鉴定卡(GPI)、革兰氏阴性菌卡(GNI)、非发酵菌卡(NFC)、酵母菌卡(YBC)、厌氧菌卡(ANI)、芽孢杆菌卡(BAC)、奈瑟氏菌嗜血杆菌卡(NHI)以及药敏检测卡等。每张检测卡对应接种1份标本,检测卡为一次性消耗品。

5.2　充填机　将待测菌的菌悬液注入试卡内。

5.3　读数器/恒温箱　可在培养过程中定时读出细菌在试卡内培养基中的生长变化值。

5.4　电脑主机/显示器/键盘/打印机　用于储存和分析资料、系统的操作和结果分析鉴定,实验结果的自动显示报告和打印。

5.5　电源稳压器和UPS在外围断电的情况下提供电脑主机约10 min持续电源。

6.VITEK系统的功能

6.1　可鉴定405种细菌

其中：GPI卡可鉴定凝固酶阳性和阴性的葡萄球菌、肠球菌、草绿色链球菌和β溶血链球菌、棒状杆菌属以及李斯特氏菌属和丹毒丝菌等51种;GNI+卡可鉴定肠杆菌科、弧菌科和非发酵菌等116种;NFC卡可鉴定不动杆菌、气单胞菌、产碱杆菌、假单胞菌、弧菌等42种;YBC卡可鉴定假丝酵母(念珠菌)、隐球菌、地霉、丝孢酵母、红酵母等34种;ANI卡可鉴定放线菌、拟杆菌、梭杆菌、乳杆菌、真杆菌、梭菌、消化链球菌等94种;BAC卡可鉴定芽孢杆菌21种;NHI卡可鉴定奈瑟氏菌、嗜血杆菌、金氏菌、摩拉氏菌、布兰汉氏菌等47种。

6.2　可对澄清液体中的微生物进行计数。

6.3　检测细菌生长曲线。

6.4　药敏试验　有70多种药物约50多种药物组合的药敏卡。

7.主要参数

7.1　仪器硬件

7.1.1　真空泵/充填站

准备阶段：用准备好的样本真空充填卡片能同时充填10张卡片。

7.1.2自动传送/读卡培养箱

充填好的卡片放入自动传送/读数培养箱后,仪器会通过内部的条码扫描识别反应及接种样本。随后仪器会自动密封卡片并将其传送至读卡培养箱中,传送带/读卡培养箱由转动的传送带及能容纳30个测试卡片并能将温度控制在34.5℃～36.5℃的培养箱组成。光学系统每小时扫描检测4次光学系统通过透射和比色系统来分析每个孔中的微生物生长情况。

7.1.3　废物自动收集箱

当一个测试完成,反应卡片将自动传送到废物箱内。废物箱中能存放收集废卡并能检测是否满箱。

7.1.4　中央控制器

该部分作为仪器管理控制部分,进行资料的储存、系统状态信息及资料的登记。软件操作基于Windows XP中文操作界面。能提供样本处理及反应卡片数据收集。能存储30，000个反应结果。所有的数据分析和报告都在计算机中进行。软件插件包括一个在线帮助系统。质控软件用于卡片质控。

7.1.5　比浊计

单波长设计用于检测试管中0.45%生理盐水悬液浓度;在液晶显示器屏上以麦氏单位的形式给出值,与细菌浓度成比例,根据测试卡片的需要决定接种的浓度。

7.1.6　变色图形显示

当操作者在键盘上输入操作指令和进行菜单选择时会有信息显示。当发生误操作时会有报警指出问题,并需确认仪器是否回到正常状态。

7.1.7　打印机

能根据操作者的要求自动打印备份最终结果及临时结果。喷墨打印机。

7.1.8　不间断电源

同时提供连接主机的不间断电源(UPS),保证突然断电时能提供至少20 min的电源供应。

7.2　一次性试剂盒的特征

7.2.1　每张64孔的卡片内含有厂家预先分配好底物粉末或抗生素,用于鉴定或药敏。

7.2.2　每张鉴定卡片都有一个条形码标签,上面有决定卡片类型、批号及失效期的序列号。

7.2.3　每张卡片都有塑料薄膜防止污染和渗漏。

7.2.4　鉴定和药敏由2种不同反应卡片组成。(www.xing528.com)

7.2.5　反应卡中含有能在测试过程中不同孔产生颜色和浊度变化的底物。

7.2.6　每张鉴定测试反应卡上有按照参数的特殊的生化因子。

7.2.7　在看生化反应结果时不需要附加试剂。

7.2.8　药敏测定卡上至少有按照研究得出的20种药物的多级浓度。

7.2.9　接种时,反应卡片会被自动充填及封口,关闭系统确保生物安全。

7.2.10　反应卡片放进培养/读卡器中后,将一个接一个地重复进行培养和光学读数。

7.3　电源要求：输入电压：220/240V;输入电流：最大2.5　A;输入频率：50 Hz;热散逸：1025 BTU/hr;功率消耗300～600 W。

7.4　尺寸大小：60 cm×72 cm×68 cm;重：75 kg。

7.5　环境要求：操作温度：15℃～30℃;湿度：20%～80%,无凝结气体。

8.操作规程

8.1　菌悬液配制

0.45　% NaCL溶液PH 4.5　～7.2　;在适合的培养基上分纯的18～24/48 h的细菌;无菌棉签/接种环菌液浊度要求：鉴定卡：GN 0.5　～0.63　;GP 0.5　～0.63　;YST 1.8　～2.2　;NH 2.7　～3.3　;ANC 2.7　～3.3　BCL 1.8　～2.2　。药敏卡：AST-GNxx 3.0　mL盐水+145μL,0.5　～0.63　麦氏单位菌悬液,混匀。AST-GPxx 3.0　mL盐水+280μL,0.5　～0.63　麦氏单位菌悬液,混匀。

使用前将卡片和盐水瓶从冰箱取出,放室温15～20 min,充分复温。在载卡架上放一次性塑料试管,每管中加入3 mL,0.45%NaCl溶液,按照以上浊度要求配置菌悬液。

8.2　进入VITEK 2 COMPACT应用软件主界面,点击载卡架编辑图标,依次点击图3-3、图3-4、图3-5中圈出的图标后进入条码输入界面图3-6。