细菌生化鉴定方法简介

细菌在生长繁殖过程中要进行一系列复杂的生化反应,该过程的分解代谢是将复杂的有机物降解为结构简单的化合物;合成代谢则是将小分子化合物合成为复杂的菌体成分。分解和合成代谢同时进行,随之产生多种代谢产物,利用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢产物以及参与代谢过程的不同酶类,对鉴定细菌、细菌致病性的研究以及医学应用中均具有重要作用。利用各种生化方法检测各类细菌的代谢产物,统称为细菌的生化鉴定。各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。由于细菌特有得细胞原核生物特性,这种差异就表现得更加明显。不同细菌具有不同的酶系统,故不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同,它们对物质的代谢谱和分解产物也就不同,利用这种特点建立细菌的生化反应,在菌株的分类鉴定中具有重要意义。因此,掌握各种生化反应的原理和应用是细菌鉴定的基础。

微生物实验室可以根据实际情况或选择自主配置生化试剂手工检验、购买商品化即用型试剂(生化套装)手工检验、全自动化细菌编码分类鉴定设备及其配套生化试剂自动化检验。目前细菌的生化鉴定工作也趋向于自动化,自动化细菌编码分类鉴定设备的使用越来越广泛,使得鉴定工作更快速、更简便,同时特异性更高。以下将对细菌生化反应试验及细菌编码分类鉴定方法分别作以介绍。

(一)细菌生化反应试验

不同细菌具有各自独特的酶系统,因而对底物的分解能力各异,其代谢的产物也不相同。这些代谢产物又各具有不同的生物化学特性,为此,可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。在细菌检验工作中,除根据细菌的形态、染色、培养特性进行初步鉴定外,对绝大多数分离的未知菌的属、种鉴定,主要通过这些生物化学试验。

1.碳水化合物的代谢试验

(1)糖(醇、苷)类发酵试验

原理：由于各种细菌含有发酵不同糖(醇、苷)类的酶,故分解糖类的能力各不相同,有的能分解多种糖类,有的仅能分解1～2种糖类,还有的不能分解。细菌分解糖类后的终末产物亦不一致,有的产酸、产气,有的仅产酸,故可利用此特点以鉴别细菌。

培养基：在培养基中加人0.5%～1%的糖类(单糖、双糖或多糖)、醇类(甘露醇、肌醇等)、苷类(水杨苷、菊糖等)。培养基可为液体、半固体、固体或微量生化管四种类型。

方法：将分离的纯种细菌,以无菌操作接种到糖(醇、苷)类发酵培养基中,置培养箱中培养数小时至两周后观察结果。若用微量发酵管,或要求培养时间较长时,应保持湿度,以免培养基干燥。

结果：接种的细菌,若能分解培养基中的糖(醇、苷)类产酸时,培养基中的指示剂呈酸性反应。若产气可使液体培养基中导管内或半固体培养基内出现气泡,固体培养基内有裂隙等现象。若不分解,培养基中除有细菌生长外,无任何其他变化。

应用：是鉴定细菌最主要和最基本的试验,特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。

(2)氧化-发酵试验(O/F试验)

原理：细菌在分解葡萄糖的过程中,必须有分子氧参加的,称为氧化型。氧化型细菌在无氧环境中不能分解葡萄糖。细菌在分解葡萄糖的过程中,可以进行无氧降解的,称为发酵型。发酵型细菌无论在有氧或无氧的环境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。利用此试验可区分细菌的代谢类型。

培养基：HL：Hugh-Leifson二氏培养基。

方法：将待检菌同时穿刺接种两支HL培养基,其中一支培养基滴加无菌的液体石蜡(或其他矿物油),高度不少于1 cm。将培养基于35℃培养48 h或更长。

结果：两支培养基均无变化为产碱型或不分解糖型;两支培养基均产酸为发酵型;若仅不加石蜡的培养基产酸为氧化型。

应用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别,前者均为发酵型,而后者通常为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别。

(3)β-半乳糖苷酶试验(ONPG试验)

原理：有的细菌可产生β-半乳糖苷酶,能分解邻-硝基酚-β-D-半乳糖苷(O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG),而生成黄色的邻-硝基酚(O-nitrophenol),在很低浓度下也可检出。反应式如下：

试剂：0.75 M ONPG溶液：取80 mg溶于15 mL蒸馏水中,再加入缓冲液(6.9 g NaH2PO4溶于45 mL蒸馏水中,用30% NaOH调整pH为7.0,再加水至50 mL)5 mL,置4℃冰箱中保存。ONPG溶液为无色,如出现黄色,则不应再用。

方法：从克氏双糖铁培养基上取菌,于0.25 mL无菌生理盐水中制成菌悬液,加入一滴甲苯并充分振摇,使酶释放。将试管置37℃水浴5 min,加入0.25 mL ONPG试剂,水浴20 min～3 h观察结果。

结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应,一般在20～30 min内显色。

应用：迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性,而不发酵乳糖的细菌为阴性。本试验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。

(4)七叶苷水解试验

原理：有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素,七叶素与培养基中枸橼酸铁的二价铁离子反应,生成黑色的化合物,使培养基呈黑色。其反应式为：

培养基：七叶苷培养基、胆汁七叶苷培养基。

方法：将待检菌接种于七叶苷培养基中,培养后观察结果。

结果：培养基变为黑色为阳性,不变色者为阴性。

应用：主要用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别,前者阳性,后者阴性。也可用于革兰阴性杆菌及厌氧菌的鉴别。

(5)甲基红试验原理：某些细菌在糖代谢过程中,分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸可进一步分解,产生甲酸、乙酸、乳酸等,使培养基的pH降至4.5以下,当加入甲基红试剂则呈红色,为甲基红试验阳性。若细菌分解葡萄糖产酸量少,或产生的酸进一步转化为其他物质(如醇、酮、醚、气体和水等),则培养基的酸度仍在pH 6.2以上,故加入甲基红指示剂呈黄色,是为阴性。

培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。

方法：将待检菌接种于上述培养基中,培养2～4 d,于培养基内加入甲基红试剂,立即观察结果。

结果：呈现红色为阳性;橘红色为弱阳性;黄色为阴性。

应用：主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌,前者为阳性,后者为阴性。此外肠杆菌科中沙门氏菌属、志贺氏菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属等为阳性,而肠杆菌属、哈夫尼亚菌属则为阴性。

(6)V-P试验

原理：某些细菌在糖代谢过程中,分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸脱羧产生乙酰甲基甲醇,乙酰甲基甲醇在碱性环境中,被空气中的氧氧化为二乙酰,进而与培养基内蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用,生成红色化合物,则为V-P试验阳性。若培养基中胍基含量较少,则可加入少量含胍基化合物,如肌酸或肌酐等。试验时加入α-萘酚可加速此反应。反应式如下：

培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。

方法：将待检菌接种于上述培养基中,于35℃培养48 h后加入甲液(6%α-萘酚酒精溶液)和乙液(40% KOH溶液),振摇。

结果：在数分钟内出现红色为阳性;如无红色出现且于35℃,4 h后仍如故者即为阴性。

应用：本试验常与甲基红试验一起使用,因为前者阳性的细菌,后者通常为阴性。

2.蛋白质和氨基酸的代谢试验

不同细菌分解蛋白质能力不同,可利用不同氮源合成菌体蛋白质,可通过检测加入蛋白质分解代谢后的产物或pH变化鉴定细菌。

(1)明胶液化试验

原理：某些细菌可产生一种胞外酶-明胶酶,能使明胶分解为氨基酸,从而失去凝固力,半固体的明胶培养基成为流动的液体。

方法：将被检菌穿刺接种于明胶培养基,于22℃培养7 d,逐日观察结果。若用35℃孵育,因明胶在此温度下自行液化,故在观察结果前,先置4℃冰箱内30 min,再看结果。

结果：培养基呈液化状态为阳性。

应用：肠杆菌科细菌的鉴别,如沙雷菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、阴沟杆菌等可液化明胶,而其他细菌很少液化明胶。有些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也能液化明胶。另外多数假单胞菌也能液化明胶。

(2)吲哚(靛基质)试验

原理：某些细菌具有色氨酸酶,能分解蛋白胨水中的色氨酸生成吲哚(靛基质),当加入吲哚试剂(对位二甲氨基苯甲醛)后则形成红色的玫瑰吲哚。反应式如下：

培养基：蛋白胨水培养基。

方法：将待检菌接种于上述培养基中,于35℃培养24～48 h,沿试管壁慢慢加入吲哚试剂。

结果：于两者液面接触处出现红色为阳性,无色为阴性。

应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。

(3)硫化氢试验

原理：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸(如胱氨酸、半胱氨酸)产生硫化氢,硫化氢遇铅或亚铁离子则形成黑褐色的硫化铅或硫化铁沉淀。此试验可间接检测细菌是否产生硫化氢。其反应为：

培养基：醋酸铅培养基。

方法：将待检菌穿刺接种于醋酸铅培养基,于35℃培养24～48 h观察结果。

结果：培养基变黑为阳性,不变为阴性。

应用：主要用于肠杆菌科中属及种的鉴别。如沙门氏菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属细菌,绝大多数硫化氢阳性,其他菌属阴性。沙门氏菌属中也有硫化氢阴性菌种。

(4)尿素分解试验

原理：某些细菌具有尿素分解酶,能分解尿素产生大量的氨,使培养基呈碱性。反应式为：

培养基：尿素培养基。

方法：将待检菌接种于尿素培养基,于35℃培养18～24 h观察结果。

结果：培养基呈碱性,使酚红指示剂变红为阳性,不变为阴性。

应用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。奇异变形杆菌和普通变形杆菌脲酶阳性,另外雷氏普罗威登菌和摩根菌为阳性,而斯氏和产碱普罗威登菌阴性。

(5)苯丙氨酸脱氨酶试验

原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶,使苯丙氨酸脱去氨基,形成苯丙酮酸,加人氯化铁试剂后产生绿色反应。反应式如下：

培养基：苯丙氨酸琼脂培养基。

方法：将被检菌浓厚接种于苯丙氨酸琼脂培养基斜面上,于35℃培养18～24 h,滴加10%三氯化铁试剂3～4滴,自斜面上方流下。

结果：出现绿色为阳性。应立即观察结果，延长反应时间会引起褪色。

应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。变形杆菌属、普罗威登斯菌属和摩根菌属细菌均为阳性,肠杆菌科中其他细菌均为阴性。

(6)氨基酸脱羧酶试验

原理：具有氨基酸脱羧酶的细菌,能分解氨基酸使其脱羧生成胺(赖氨酸-尸胺,鸟氨酸-腐胺,精氨酸-精胺)和二氧化碳,让培养基变碱,使指示剂显示出来。氨基酸被特异脱羧酶作用的反应式如下：

培养基：氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照培养基。

方法：将被检菌分别接种于赖氨酸(或鸟氨酸或精氨酸)培养基和氨基酸对照培养基中,并加入无菌液体石蜡或矿物油,于35℃培养1～4 d,每日观察结果。

结果：对照管应呈黄色,测定管呈紫色(指示剂为溴甲酚紫)为阳性,若测定管呈黄色为阴性。若对照管呈现紫色则试验无意义,不能作出判断。

应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。如沙门氏菌属中除伤寒和鸡沙门氏菌外,其余沙门氏菌的赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶均为阳性。志贺氏菌属除宋内和鲍氏志贺氏菌外,其他志贺氏菌均为阴性。

3.碳源和氮源利用试验

(1)枸橼酸盐利用试验

原理：某些细菌能以铵盐为唯一氮源,并且利用枸橼酸盐作为唯一碳源,可在枸橼酸盐培养基上生长,分解枸橼酸盐,使培养基变碱性。

培养基：枸橼酸盐培养基。

方法：将被检菌接种于枸橼酸盐培养基,于35℃培养1～4 d,每日观察结果。

结果：培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由淡绿色变为深蓝色为阳性,不能利用枸橼酸盐作为碳源的细菌,在此培养基上不能生长,培养基不变色为阴性。

应用：用于肠杆菌科中菌属间的鉴定。在肠杆菌科中埃希氏菌属、志贺氏菌属、爱德华菌属和耶尔森菌属均为阴性,沙门氏菌属、克雷伯菌属通常为阳性。

(2)丙二酸盐利用试验

原理：有的细菌可利用丙二酸盐作为唯一碳源,将丙二酸盐分解生成碳酸钠,使培养基变碱。

培养基：丙二酸盐培养基。

方法：将被检菌接种于上述培养基,35℃培养24～48 h后观察结果。

结果：培养基由淡绿色变为深蓝色为阳性,颜色无变化为阴性。

应用：肠杆菌科中属间及种的鉴别。克雷伯菌属为阳性,枸橼酸杆菌属、肠杆菌属和哈夫尼亚菌属中有些菌种也呈阳性,其他菌属均为阴性。

4.各种酶类试验

(1)氧化酶试验

原理：氧化酶(细胞色素氧化酶)是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌,首先使细胞色素C氧化,再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化,生成有色的醌类化合物。反应式如下：

试剂：1 %盐酸四甲基对苯二胺或1 %盐酸二甲基对苯二胺。

方法：常用方法有三种：

1)菌落法：直接滴加试剂于被检菌菌落上。

2)滤纸法：取洁净滤纸一小块,蘸取菌少许,然后加试剂。

3)试剂纸片法：将滤纸片浸泡于试剂中制成试剂纸片,取菌涂于试剂纸上。

结果：细菌在与试剂接触10 s内呈深紫色,为阳性。为保证结果的准确性,分别以铜绿假单胞菌和大肠埃希菌作为阳性和阴性对照。

应用：主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别,前者为阳性,后者为阴性。奈瑟菌属、莫拉菌属细菌也呈阳性反应。

(2)过氧化氢酶试验(触酶试验)

原理：具有过氧化氢酶的细菌,能催化过氧化氢生成水和新生态氧,继而形成分子氧出现气泡。

试剂：3%过氧化氢溶液。

方法：取菌置于洁净的试管内或玻片上,然后滴加3%过氧化氢数滴;或直接滴加3%过氧化氢于不含血液的细菌培养物中,立即观察结果。

结果：有大量气泡产生者为阳性,不产生气泡者为阴性。

应用：革兰阳性球菌中,葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶,而链球菌属为阴性,故此试验常用于革兰阳性球菌的初步分群。

(3)硝酸盐还原试验

原理：硝酸盐还原反应包括两个过程：一是在合成过程中,硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨,再由氨转化为氨基酸和细胞内其他含氮化合物;二是在分解代谢过程中,硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。能使硝酸盐还原的细菌从硝酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐和其他还原性产物。但硝酸盐还原的过程因细菌不同而异,有的细菌仅使硝酸盐还原为亚硝酸盐,如大肠埃希菌;有的细菌则可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵;有的细菌能使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮,如假单胞菌等。反应式如下：

硝酸盐还原试验系测定还原过程中所产生的亚硝酸,其反应式是：

培养基：硝酸盐培养基。

试剂：甲液(对氨基苯磺酸0.8 g+5 mol/L醋酸100 mL);乙液(α-奈胺0.5 g+5 mol/L醋酸100 mL)。

方法：将被检菌接种于硝酸盐培养基中,于37℃培养1～4 d,将甲、乙液等量混合后(约0.1 mL)加入培养基内,立即观察结果。

结果：出现红色为阳性。若加入试剂后无颜色反应,可能是：①硝酸盐没有被还原,试验阴性;②硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而导致假阴性结果,这时应在试管内加入少许锌粉,如出现红色则表明试验确实为阴性。若仍不产生红色,表示试验为假阴性。

若要检查是否有氮气产生,可在培养基管内加入一小导管,如有气泡产生,表示有氮气生成。

应用：本试验在细菌鉴定中广泛应用。肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐;铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌等假单胞菌可产生氮气;有些厌氧菌如韦荣球菌等试验也为阳性。

(4)脂酶试验

原理：有的细菌产生脂酶,可分解脂肪成游离的脂肪酸,从而使培养基中与脂肪结合形成无色化合物的维多利亚蓝释放出来,呈现深蓝色。

培养基：脂酶培养基(含维多利亚蓝)。

方法：将被检菌接种于上述培养基中,于37℃培养24 h。

结果：培养基变为蓝色为阳性,阴性为粉红色或无色。

应用：主要用于厌氧菌的鉴别。类杆菌属中的中间类杆菌产生脂酶,其他类杆菌则阴性;芽孢梭菌属中产芽孢梭菌、肉毒梭菌和诺维梭菌也有此酶,而其他梭菌阴性。

(5)卵磷脂酶试验

原理：有的细菌产生卵磷脂酶(α-毒素),在钙离子存在时,此酶可迅速分解卵磷脂,生成甘油酯和水溶性磷酸胆碱。

培养基：1 %卵黄琼脂平板。

方法：将被检菌划线接种或点种于卵黄琼脂平板上,于35℃培养3～6 h。

结果：若3 h后在菌落周围形成乳白色混浊环,即为阳性,6 h后混浊环可扩展至5～6 mm。

应用：主要用于厌氧菌的鉴定。产气荚膜梭菌、诺维梭菌产生此酶,其他梭菌为阴性。

(6)DNA酶试验

原理：某些细菌产生DNA酶,可使长链DNA水解成寡核苷酸链。因为长链DNA可被酸沉淀,寡核苷酸链则溶于酸,所以当在菌落平板上加入酸后,会在菌落周围出现透明环。

培养基：0.2% DNA琼脂平板。

方法：将被检菌点种于上述平板上,于35℃培养18～24 h,然后用l mol/L盐酸覆盖平板,观察结果。

结果：在菌落周围出现透明环为阳性,无透明环为阴性。

应用：在革兰阳性球菌中只有金黄色葡萄球菌产生DNA酶,在肠杆菌科中沙雷菌和变形杆菌产生此酶,故本试验可用于细菌的鉴别。

(7)凝固酶试验

原理：致病性葡萄球菌可产生两种凝固酶。一种是结合凝固酶,结合在细胞壁上,使血浆中的纤维蛋白原变成纤维蛋白而附着于细菌表面,发生凝集,可用玻片法测出。另一种是分泌至菌体外的游离凝固酶,作用类似凝血酶原物质,可被血浆中的协同因子激活变为凝血酶样物质,而使纤维蛋白原变成纤维蛋白,从而使血浆凝固,可用试管法测出。

方法：①玻片法：取人或兔血浆和盐水各一滴,分别置于洁净的玻片上,挑取被检菌分别与血浆和盐水混合。②试管法：取试管2支,各加0.5 mL人或兔血浆,挑取被检菌和阳性对照菌分别加入血浆中并混匀,于37℃水浴3～4 h。

结果：玻片法以血浆中有明显的颗粒出现而盐水中无自凝现象判为阳性;试管法以血浆凝固判为阳性。

应用：作为鉴定葡萄球菌致病性的重要指标,也是葡萄球菌鉴别时常用的一个试验。

(8)CAMP试验(Christis Atkins & Munch-Peterson Test)

原理：B群链球菌能产生CAMP因子,可促进葡萄球菌的β-溶血素溶解红细胞的活性,因此在两菌(B群链球菌和葡萄球菌)的交界处溶血力增加,出现矢形(半月形)的溶血区如图3-1。(www.xing528.com)

图3-1　CAMP试验示意图

培养基：血琼脂平板。

方法：先以产β-溶血素的金黄色葡萄球菌划一横线接种于血琼脂平板上,再将被检菌与前一划线作垂直划线接种,两线不能相交,相距0.5～1 cm,于37℃培养18～24 h,观察结果。每次试验都应设阴性和阳性对照。

结果：在两划线交界处出现箭头样的溶血区为阳性。

应用：在链球菌中,只有B群链球菌CAMP试验阳性,故可作为特异性鉴定。

(9)胆汁溶菌试验

原理：胆汁或胆盐可溶解肺炎链球菌,可能是由于胆汁降低细胞膜表面的张力,使细胞膜破损

或使菌体裂解;或者是由于胆汁加速了肺炎链球菌本身自溶过程,促使细菌发生自溶。

试剂：10%去氧胆酸钠或纯牛胆汁。

方法：①平板法：取10%去氧胆酸钠溶液一接种环,滴加于被测菌的菌落上,置35℃,30 min后观察结果。②试管法：被检菌培养物2支,各0.9 mL,分别加入10%去氧胆酸钠溶液和生理盐水(对照管)0.l mL,摇匀后置35℃水浴10～30 min,观察结果。

结果：平板法以“菌落消失”判为阳性;试管法以“加胆盐的培养物变透明,而对照管仍混浊”判为阳性。

应用：主要用于肺炎链球菌与甲型链球菌的鉴别,前者阳性,后者阴性。

5.抑菌试验

(1)O/129抑菌试验

原理：O/129(二氨基喋啶)对弧菌属细菌有抑制作用,而对气单胞菌属细菌无抑制作用。

培养基：碱性琼脂平板。

方法：将待检菌均匀涂布于碱性琼脂平板上,镊取O/129纸片(含药40μg)贴于平板上,35℃培养18～24 h观察结果。

结果：出现抑菌环为敏感,无抑菌环为耐药。

应用：用于弧菌科的属间鉴别,弧菌属、邻单胞菌属对O/129敏感,而气单胞菌属耐药。

(2)杆菌肽试验

原理：A群链球菌对杆菌肽几乎全部敏感,而其他群链球菌绝大多数对其耐药。

培养基：血液琼脂平板。

方法：将待检菌纯培养物(肉汤)均匀涂布于血液琼脂平板上,稍干后贴上0.04 U/片的杆菌肽纸片,35℃培养18～24 h观察结果。

结果：抑菌环直径>10 mm为敏感,抑菌环直径<10 mm为耐药。

应用：用于A群链球菌与非A群链球菌的鉴别。

(3)奥普托欣(Optochin)试验

原理：几乎所有肺炎链球菌对Optochin敏感,而Optochin对其他链球菌则无抑制作用。

培养基：血液琼脂平板。

方法：将待检菌菌落或肉汤培养液均匀涂布于血液琼脂平板上,稍干后贴上含5μg/片的Optochin纸片,35℃培养18～24 h观察结果。

结果：抑菌环直径>14 mm为敏感,若抑菌环直径≤14 mm,对此菌株应再做胆汁溶菌试验,以证实是否为肺炎链球菌。

应用：主要用于肺炎链球菌与其他链球菌的鉴别。

(4)氰化钾抑菌试验

原理：有的细菌(如沙门氏菌、志贺氏菌等)的呼吸酶系统可被一定浓度的氰化钾所抑制而不生长,这是由于细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶以铁卟啉结合,使这些酶失去活性,因此细菌生长受到抑制。有的细菌(如哈夫尼亚菌属细菌)在一定浓度氰化钾的培养基中仍能生长,借此试验可用以鉴别某些细菌。

方法：以无菌程序取试验细菌24 h肉汤培养物一接种环,接种氰化钾培养基,同时接种于不含氰化钾的同样培养基作为对照,37℃培养48 h,观察细菌是否生长。

结果：若细菌在氰化钾培养基上生长(不抑制)为阳性,不生长(抑制)为阴性。

应用：在含1∶13300或1∶10000氰化钾培养基中,肠杆菌科中沙门氏菌属、志贺氏菌属和埃希菌属细菌的生长受到抑制,而其他各菌属的细菌均可生长。

注意事项：氰化钾抑制细菌生长的能力与接种量以及培养基中营养成分有关,因此,试验时接种菌量必须控制,不宜过多,同时培养基所用蛋白胨的质量必须稳定。

6.嗜盐性试验

原理：一般致病菌(如肠道杆菌)在30 g/L的氯化钠浓度的培养基上不生长或生长发育不好,但可在无盐培养基上生长。然而致病性嗜盐菌在含30～60 g/L氯化钠的高盐培养基上生长良好,但不能在无盐培养基上生长。也有少数细菌有耐盐性,如葡萄球菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌、鼠疫耶尔森菌等,在无盐和高盐培养基上均能生长,但生长不茂盛。

方法：取试验菌,分别接种一支无盐葡萄糖蛋白胨水和一支50～60 g/L的氯化钠葡萄糖蛋白胨水中,37℃培养6～12 h,观察生长情况。

结果：在无盐葡萄糖蛋白胨水不生长,在50～60 g/L的氯化钠葡萄糖蛋白胨水中生长为嗜盐菌;反之为非嗜盐菌。在两种培养基中均生长为耐盐菌。

(二)细菌鉴定方法——细菌编码分类鉴定

采用双歧索引分类鉴定法分类鉴定细菌,操作繁杂且时间较长,不能满足公共卫生突发事件的处理。在双歧索引分类鉴定的基础上,在了解大量已知菌生化特性的基础上,将相关的生化指标集合成系列(套试剂),使未知菌的鉴定更加简易、敏感和快速,在处理公共卫生突发事件中,有利于快速鉴定病原菌。

1.细菌编码分类鉴定的原理

应用大量已知菌相关生化反应出现的频率得出的数据进行分析,如肠道菌,选用15种或16种或20种生化反应,通过适当的组合分成几个反应组,根据不同种的细菌生化反应出现的阴性或阳性结果,通过对数以万计的已知菌进行实验,归纳出不同的反应类型。对这些反应类型经数字化处理,再进行数字编码。不同种的细菌产生不同的编码类型,将其整理成数码册。在鉴定细菌时,通过对生化反应出现的阳性或阴性反应结果整理出数码,于编码册中找出此数码相对应的相关菌种,在编码册中可找出鉴定为相关菌的可能性的大小(百分率表示),从而提高分析力度。

2.细菌编码分类鉴定的常见程序(如图3-2)

应用的生物化学试验的项目数量,各鉴定系统可有不同,但鉴定程序大致相同。

图3-2　细菌编码分类鉴定程序

3.常见的细菌编码分类鉴定系统(套试剂)

(1)Micro-ID(肠杆菌科细菌微量鉴定系统)

该系统包括15种生化反应,即VP试验、硝酸盐还原试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、硫化氢试验、吲哚试验、鸟氨酸脱羧酶试验、赖氨酸脱羧酶试验、丙二酸盐利用试验、尿素酶试验、七叶苷试验、ONPG试验、阿拉伯糖试验、侧金盏花醇试验、肌醇试验、山梨醇试验。上述15种生化试验依次序每三项分成一组,共分成五组,每组的第三项试验阳性者计1分,阴性计0分,以每组分数之和按次序排列为五位数字,在编码册中查找得出相应菌名。对有疑问者并提示增加必要的补充试验,得出相应的病原学鉴定结果。

(2)Minitek鉴定系统：该系统包括32种生化试验,鉴定板有12个凹孔,根据具体情况选择12种生化反应试剂,分别加入凹槽中并放入指示剂纸片,判读结果时与标准板进行对照,得出鉴定菌名。

(3)Minibact鉴定系统：用于肠杆菌科系菌的鉴定,包括16种生化反应,依次为VP试验、硝酸盐还原试验、硫化氢试验、吲哚试验、鸟氨酸脱羧酶试验、赖氨酸脱羧酶试验、丙二酸盐利用试验、尿素酶试验、七叶苷试验、ONPG试验、侧金盏花醇试验、肌醇试验、山梨醇试验。生化试验在微孔板上进行,16种生化反应依次每三项分做一组,最后一组只包括山梨醇试验一项,每组每项计分方法与Micro-ID相同,第六组山梨醇一项试验阳性反应结果按4分计,最后产生六位数字的编码,在编码本中查出相应的菌名。有疑问者根据提示增加必要的补充试验,以帮助最终得出确切的病原学鉴定结果。

(4)Bio-Test鉴定系统：此鉴定系统包括24种生化反应,可以对肠杆菌科细菌及非发酵菌进行鉴定。此系统亦在为微孔板上进行,鉴定未知菌时,需将各项反应结果与鉴定表中的各项生化试验逐一进行比较,从而找出相应的菌,鉴定表中将常见的肠杆菌科细菌及非发酵菌的菌种列出。

(5)API鉴定系统：该系统始于1970年,目前API鉴定系统已有15个系列,可鉴定600种以上的细菌。API系商品名,是analytic products incorporated的缩写字。常用的API鉴定系统见表3-1。API试剂贮存温度为2℃～8℃。

表3-1　API主要鉴定系统

1)API 20E：肠杆菌科细菌鉴定系列,可鉴定108种细菌,可在18～24 h内得出鉴定结果。20种生化试验是：β-半乳糖苷酶(ONPG)、精氨酸水解试验(ADH)、赖氨酸脱羧试验(LDC)、鸟氨酸脱羧试验(ODC)、枸橼酸盐利用实验(CIT)、硫化氢试验(H2S)、尿素酶试验(URE)、色氨酸脱氨试验(TDA)、吲哚试验(IND)、VP试验(VP)、明胶水解试验(GEL)、葡萄糖利用实验(GLU)、甘露醇利用实验(MAN)、肌醇试验(INO)、山梨醇利用试验(SOB)、鼠李糖利用试验(RHA)、蔗糖利用实验(SAC)、蜜二糖利用试验(MEL)、淀粉利用试验(AMY)、阿拉伯糖利用试验(ARA)。

2)API 20NE：非发酵菌鉴定系列,可在24～48 h内鉴定64种以上的细菌。所包括的生化实验是：硝酸盐还原试验(NIT)、IND、GLU、ADH、URE、七叶苷水解试验(ESC)、GEL、GLU、ARA、MNE、MAN、N-乙酰-氨基葡糖糖同化试验(NAG)、麦芽糖利用试验(MAL)、葡糖糖酸盐利用试验(GNT)、暌酸利用实验(CAP)、己二酸利用试验(ADI)、苹果酸利用实验(MLT)、枸橼酸试验(CII)、苯乙酸试验(RAC)。

3)API 10E鉴定系列：主要用于肠杆菌科细菌的初步筛选。可初步鉴定50余种细菌。10种生化试验是：ONPG、ADH、LDC、ODC、CIT、H2S、URE、TDA、IND和VP试验。

4)快速API 20E：用于鉴定肠杆菌科细菌,4 h内即可得出鉴定结果,缩短报告时间,以便及时采取治疗措施。20种生化试验是：ONPG、LDC、ODC、URE、CIT、磷酸三苯脂芳胺酶试验(PPA)、丙二酸盐同化试验(MNT)、ESC、ARA、木糖试验(XYL)、侧金盏花醇试验(ADO)、RHA、纤维二糖试验(CEL)、MEL、SAL、海藻糖试验(TRE)、棉子糖试验(RAF)、GLU、IND、VP试验。

5)API Strep(链球菌鉴定系列)：可鉴定链球菌及相关菌共47种。20种生化反应是：VP、马尿酸试验(HIP)、ESC、吡咯烷酮烯胺酶试验(PYRA)、α-半乳糖苷酶试验(α-GAL)、β-葡萄糖醛酸苷酶试验(β-GUR)、ONPG、碱性磷酸酶试验(PAL)、亮氨酸脱基肽酶(LAP)、ADH、核糖醇试验(RIB)、ARA、MAN、SOR、乳糖试验(LAC)、TRE、菊糖发酵试验(INU)、RAF、苦杏仁苷发酵试验(AMD)、甘油发酵试验(GIY)。

6)API Staphy(API葡萄球菌鉴定系列)：可鉴定22种葡萄球菌。包括20种生化反应试验：GIU、果糖试验(FRU)、甘露糖试验(MNF)、麦芽糖试验(MAC)、LAC、TRE、MAN、XLT、MEL、NIT、PAL、VP、RAF、XYL、蔗糖试验(SAC)、α-甲基-D-甘露糖试验(MDG)、NAG、ADH、URE。

7)API 20A(厌氧菌鉴定系列)：可鉴定67种厌氧菌。所包括的生化试验是：IND、URE、GLU、MAN、LAC、SAC、MAL、水杨苷试验(SAL)、ARA、GEL、ESC、GLY、CEL、MNE、松三糖发酵试验(MLZ)、RAF、SOB、RHA、TRE。

8)API 20Caux(酵母样菌鉴定系列)：可在24～48 h对43种酵母样菌作出鉴定。所包括的生化试验是：GLU、乙酮基-葡糖糖酸盐同化试验(IKG)、糖原同化试验(GLY)、ARA、XYL、半乳糖发酵试验(GAL)、ADO、XLT、肌醇发酵试验(INO)、SOB、NAG、α-甲基-D-葡糖糖苷发酵试验(MDG)、CEL、LAC、MAL、蔗糖同化试验(SAL)、TRE、RAF、MLZ。

9)其他：除前述常用的API鉴定系列外,还有用于李斯特菌鉴定的API Listeria、用于鉴定弯曲菌的API Campy、用于鉴定奈瑟菌及嗜血杆菌的API NH、用于鉴定棒状杆菌的API Coryne以及用于研究工作的API 50CH。API 50CH可以鉴定52种乳杆菌、24种芽孢杆菌、111种肠杆菌科细菌。

(6)API鉴定系列操作程序

分离培养(或纯培养)→制备菌悬液(比浊法)→加样器加样(根据不同要求选择API鉴定系列)→35℃温箱孵育→判读结果→查找编码(编码本)找出相应细菌名称。

(7)应用API鉴定系列结果判读

具体做法以API 20E为例,将20项生化试验依次分为七个组,每三项作为一组,最后一组只包括两项。每组的第一项为阳性反应结果计1分,每组的第二项为阳性反应结果计2分,每组的第三项为阳性反应结果计4分,第七组只有第一、第二两项。根据阳性、阴性反应结果的不同,将七个组的分数分别累加,得出一个七位数的编码,在编码本中查找以得出相应的细菌名称。如某一未知菌得到这样的结果,如表3-2所示,在编码本中查找6704752,从而得出相应的细菌名称为沙门氏菌。

注：+：为阳性反应;-：为阴性反应。

生化英文缩写及中文对照见表3-3。

表3-3　生化反应中英文对照表

二、细菌药敏检测方法概述

抗菌药物的出现,拯救了成千上万患者的生命,但随着抗菌药物的长期和广泛使用,病原体的耐药随之出现,给临床治疗带来了困难。抗菌药物敏感性试验(antimicrobial susceptibility test,AST)可预测抗菌治疗的效果,即AST试验结果为“敏感”时,治疗可能有效;试验结果为“耐药”时,使用该药物治疗肯定失败;指导临床医生选择使用抗生素,AST的结果往往在给予病人经验性治疗24～48 h之后,若AST结果为“敏感”,该治疗为有效,若结果为“耐药”,即应更换药物;提供所选择药物的依据;监测耐药性,分析耐药菌的变迁,掌握耐药菌感染病流行病学,控制和预防耐药菌感染的发生和流行。

(一)药敏试验的规则

目前我国主要以2006年临床实验室标准化协会(CLSI)以前为美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)所批准的《抗微生物药物敏感试验的执行标准》中的程序为指南。

1.适用范围

任何可引起感染的细菌,当对其药物敏感性不能由鉴定结果获得可靠预测,为确保抗菌药物适用的有效性,应进行药敏试验。细菌耐药性的流行病学调查及新抗生素的研究和评估。临床急症标本经直接涂片染色正式为单一致病时,可用标本直接作药敏试验,且药敏试验后,必须用标准方法复合一次。除此之外,不能用标本直接作药敏试验。

临床实验室可用这些方法做临床分离菌的常规抗菌药物敏感性试验,也可用以评价商业化设备能否用于临床常规试验,或由药厂或设备厂家用于试验新药或设备。在批准商业化设备投放市场以前,权威管理机构认可,这表明制造厂家已批准的产品说明中规定的微生物和抗微生物药,用该商品化设备所得的药敏结果与CLSI参考方法的试验结果基本相同。

2.试验常规抗菌药物选择

微生物实验室在分离出病原体时,必须选择合适的抗菌药物和合适的方法进行药物敏感试验,抗菌药物的选择应遵循有关指南,与医院感染科、药剂委员会和感染控制委员会的专家共同讨论决定。

在我国主要遵循临床实验室标准化研究所(CLSI)制定的抗菌药物选择原则。在标准中分成A、B、C、U、O五组,A组,包括对特定菌群的常规试验并常规报告的药物;B组,包括一些临床上重要的,特别是针对医院内感染的药物,也可用于常规试验,但只是选择性地报告;C组,包括一些替代性或补充性的抗菌药物,在A、B组过敏或者耐药时选用;U组,仅用于治疗泌尿道感染的抗菌药物;O组,对该组细菌有临床适应证但一般不允许常规试验并报告的药物。

3.药敏试验判断标准

采用一菌一药一条标准的原则进行判断,不同的方法有其相应的判断标准。推荐的解释标准根据美国通常的用药剂量方案和给药途径而定。

针对抑菌环直径测量值报告敏感、中介或耐药,具体定义如下：

(1)敏感(S)：“敏感”类是指分离菌株能被使用推荐剂量在感染部位通常可达到抗微生物药物浓度所抑制;

(2)中介(I)：“中介”类指分离菌株的抗微生物药物MIC接近于血液和组织中通常可达到的水平,而抗微生物的部位具有临床效力(如尿液中的喹诺酮类和β-内酰胺类)或者可用高于正常剂量的药物进行治疗(如β-内酰胺类)。此分类还包括一个缓冲区,它可以避免微小的,未能控制的技术因素造成重大的结果解释错误,特别是对那些药物毒性范围窄的药物;

(3)耐药(R)：“耐药”类是指分离菌株不被常规剂量用药通常可达到的药物浓度所抑制,和/或证明抑菌环直径落在可存在某些特定的微生物耐药机制范围(如β-内酰胺酶),并且治疗研究显示药物对分离菌株的临床疗效不可靠。

4.药敏试验的质量控制

药敏试验的精确度与准确性受多种因素的影响,为了保证结果的准确,必须进行质量保证工作。

(1)选择适宜菌株作为质控菌。

(2)质控菌株与待测标本按标准方法同步进行药敏试验。

(3)药敏试验的全过程都应通过测试相应的质控菌株来监控,对每种药每种菌的30次试验中失控结果不能超过3个。若30天监控结果完全符合要求,可将每天质控转为每周质控。

(二)药敏试验方法

细菌的药物敏感试验是指在体外测定抗菌药物抑制或杀死细菌能力试验,简称药敏试验。抗菌药物是指具有杀菌或抑菌活性的抗生素和化学合成药物。

近年来随着抗菌药物的广泛使用,尤其是广谱抗菌药物的不规范使用甚至滥用,造成了细菌抗药突变株大量出现。由于耐药质粒的传递、基因突变和抗菌药物的筛选作用,耐药菌株不断增多,鉴于细菌的耐药差异,在细菌鉴定和流行病学研究中,可根据细菌耐药谱对细菌进行分型。已用耐药谱进行分型得细菌又很多,如沙门氏菌属、志贺氏菌属、克雷伯菌属、金黄色葡萄球菌属、变形杆菌、铜铜绿假单胞菌和艰难梭菌等。

药敏试验方法有多种,如纸片扩散法、稀释法、E-试验法、联合药敏试验、自动化检测法、分子生物学方法等,目前常用的方法是纸片扩散法和稀释法,多用于需氧菌和兼性厌氧菌。

1.稀释法

稀释法时体外定量测定抗菌药物抑制生长活性的方法,所获结果比较准确,常被用作校正其他方法的标准。

原理：将药物按一定规律稀释成一系列浓度后,与等量的细菌作用,经培养后观察期能抑制细菌生长的最低浓度即MIC,该法不仅适合需氧菌、兼性厌氧菌的测定,也适合厌氧菌的测定。由于所用培养基的物理性状不同,稀释法又分为肉汤稀释法和琼脂稀释法。

(1)肉汤稀释法

有常量稀释法(macrodilution)和微量稀释法(microdilution),前者含药肉汤含量每管为≥1.0 mL(通常2 mL),后者每孔含0.1 mL,商品化的微量稀释板上含有多种经对倍系列稀释的冻干抗生素,操作方便,广泛应用于临床。

1)培养基

使用M-H肉汤,需氧菌、兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在该培养液中加入补充基可支持流感嗜血杆菌、链球菌生长。培养基制备完毕后应校正pH为7.2～7.4(25℃)。离子校正的MH肉汤(cation-adjusted Muller-Hinuton broth,CAMHB)为目前推荐的药敏试验培养液。

2)药物稀释

①药物原液制备：抗菌药物直接购于厂商或相关机构,所需的溶液量或粉剂量可根据下述两公式进行计算。

配制各种抗菌药物的溶剂根据药物性能选择蒸馏水、pH 6.0,0.1 mol/L磷酸盐缓冲液等。一般原液浓度不低于1000 g/mL或10倍于最高测试浓度,原液应贮存于-60℃以下,保存期不超过6个月。

②稀释抗菌药物的制备：2倍系列稀释,使其终浓度(μg/mL)为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125。

3)菌种接种

配制0.5麦氏浓度菌液,用肉汤(常量稀释法)、蒸馏水或生理盐水(微量稀释法)稀释菌液,使最终菌液浓度(每管或每孔)为5×l05 CFU/mL,稀释菌液于15 min内接种完毕,35℃孵育16～20 h,当试验菌为嗜血杆菌属、链球菌属孵育时间为20～24 h,试验葡萄球菌和肠球菌对苯唑西林和万古霉素的药敏试验孵育时间必须满24 h以上。

4)结果判断

以在试管内或小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC(μg/mL)。甲氧苄胺嘧啶或磺胺药物的肉汤稀释法敏感试验的终点判断,以细菌数为阳性对照的80%即可作为判断细菌生长指标。微量稀释法时,常借助于比浊计判别是否细菌生长。

(2)琼脂稀释法

琼脂选择法是将药物混匀于琼脂培养基中,配制含不同浓度药物平板,使用多头接种器接种细菌,经孵育后观察细菌生长情况,以抑制细菌生长的琼脂平板所含药物浓度测得MIC。

1)培养基

M-H琼脂为一般菌药敏试验的最佳培养基,调整pH在7.2～7.4,过高或过低的pH会影响药物效能。

2)含药琼脂制备

将已稀释的抗菌药物按1：9(配置的药物溶液：琼脂培养基)加入,加热溶解琼脂,在45℃～50℃水浴中平衡融化MH琼脂中,充分混合倾入平皿,琼脂厚度为3～4 mm。室温凝固后的平皿装入密闭塑料袋中,置2℃～8℃,贮存日期为5天,对易降解药物如含头孢克洛,在使用48 h之内制备平板,使用前应在室温中平稳放于孵育箱或层流罩中30 min以使琼脂表面干燥。

3)细菌接种

将0.5麦氏比浊度菌液稀释10倍,以多头接种器吸取(约为1～2μg)接种于琼脂表面,稀释的菌液于15 min内接种完毕,接种后置35℃孵育16～20 h(MRS、VRE孵育时间需满24 h),奈瑟菌属、链球菌属细菌置于5% CO2、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。

4)结果判断

将平板置于暗色、无反光表面上判断试验终点,以抑制细菌生长的药物稀释度为终点浓度(含甲氧苄胺嘧啶平板上磺胺可见少许散在细菌生长)。

试验菌的结果报告可用MIC(μg/mL)或用敏感(S)、中介(I)和耐药(R)报告。

2.纸片琼脂扩散法

(1)试验原理

将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上,纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度,在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制,从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度,并与该药对测试菌的MIC呈负相关关系。

(2)培养基和抗菌药物纸片

1)抗菌药物纸片选择直径为6.35 mm,吸水量为20μL的专用药敏纸片用逐片加样或浸泡方法使每片含药量达规定所示。含药纸片密封贮存2℃～8℃或-20℃无霜冷冻箱内保存,β-内酰胺类药敏纸片应冷冻贮存,且不超过1周。使用前将贮存容器移至室温平衡1～2 h,避免开启贮存容器时产生冷凝水。

2)培养基水解酪蛋白(MH)培养基是NCCLS采用的兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培养基,pH为7.2～7.4,对那些营养要求高的细菌如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、链球菌等需加人补充物质。琼脂厚度为4 mm。配置琼脂平板当天使用或置塑料密封袋中4℃保存,使用前应将平板置35℃孵育箱孵育,使其表面干燥。

(3)细菌接种

细菌接种采用直接菌落或细菌液体生长方法。用0.5麦氏比浊标准的菌液浓度,校正浓度后的菌液应在15 min内接种完毕。接种步骤如下：①用无菌棉拭子蘸取菌液,在管内壁将多余菌液旋转挤去后,在琼脂表面均匀涂片接种3次,每次旋转平板60°,最后沿平板内缘涂抹1周;②平板置室温下干燥3～5 mm,用纸片分离器或无菌镊将含药纸片紧贴于琼脂表面,各纸片中心相距>24 mm,纸片距平板内缘>15 mm;③置35℃孵育箱16～18 h后阅读结果,对甲氧西林和万古霉素敏感试验结果应孵育24 h。

(4)结果判断和报告

用精确度为l mm的游标卡尺量取抑菌圈直径(抑菌圈的边缘应是无明显细菌生长的区域),当葡萄球菌对苯唑西林的药敏试验或肠球菌对万古霉素的药敏试验,围绕纸片周围只要有极少细菌生长均提示为耐药。对另外一些菌,在抑菌圈内有散在菌落生长提示可能是混合培养,必须再分离鉴定及试验,也可能提示为高频突变株。根据NCCLS标准,对量取的抑菌圈直径作出“敏感”“耐药”和“中介”的判断。

3.E试验

E试验(Epsilometer-test)是一种结合稀释法和扩散法原理对微生物药敏试验直接定量的药敏试验技术。

(1)E原理

E试条是一条5 mm×50 mm的无孔试剂载体,一面固定有一系列预先制备的,浓度呈连续指数增长稀释抗生素,另一面有读数和判别的刻度抗生素的梯度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的宽度范围,其斜率和浓度范围对判别有临床意义的MIC范围和分界点值具有较好的关联。

将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上,经孵育过夜,围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈,圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗生素抑菌圈细菌的特定浓度,又称抑制浓度(IC),它与MIC呈高度相关。

(2)培养基

需氧菌和兼性厌氧菌：M-H琼脂;MRSA/MRSE：M-H琼脂+2%NaCl;肺炎链球菌：M-H琼脂+5%脱纤维羊血;厌氧菌：布氏杆菌血琼脂;嗜血杆菌：HTM;淋病奈瑟菌：GC琼脂+1%添加剂。

(3)细菌接种和加样

使用厚度为4 mmM-H琼脂平板,用0.5麦氏浓度的对数期菌液涂布,待琼脂平板完全干燥,用E试验加样器或镊子将试条放在已接种细菌的平板表面,试条全长应与琼脂平板紧密接触,试条MIC刻度面朝上,浓度最大处靠平板边缘。采用NCCLS 2002 AST执行标准推荐孵育条件。

(4)结果判断和报告

读取椭圆环与E试验试条的交界点IC值。E试验IC值与NCCLS的稀释法MIC参考值高度相关,两者直接相对应,NCCLS MIC折点值适用于E试验。但在判断结果时出现和细菌、药物、耐药机制和技术处理有关判断问题时应予以修正。

4.药物敏感试验结果解释

不论是抑菌圈的量取或MIC,IC值读取,根据NCCLS标准,最终以“敏感”、“耐药”和“中介”报告。药敏试验中,“敏感”即表示测试菌可被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭;“耐药”即表示测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制,临床治疗无效。“中介”者提示该细菌对常规用药体液或组织中的药物浓度的反应率低于敏感株,但在一些部位(如尿液中的喹诺酮类)或者使用高于正常给药量(如β-内酰胺类)临床上使用有疗效。