商业无菌是指杀灭食品中所污染的病原菌、产毒菌以及正常储存和销售条件下能生长繁殖,并导致食品变质的腐败菌,从而保证食品正常的货架寿命。自十九世纪拿破仑时代发明罐头以来,随着食品安全问题越来越受到各国政府的重视,中国加入WTO,为了保护消费者健康,促进罐头食品市场流通,罐头工业迅猛发展,在食品工业中已占得一块很大的席位,罐头食品的微生物检验更显得尤为重要。罐头食品的微生物检验主要为商业无菌检验。商业无菌指不含危害公共健康的致病菌和毒素;不含任何在产品储存、运输及销售期间能繁殖的微生物;在产品有效期内保持质量稳定和良好的商业价值。
商业无菌的检测我国执行的标准是GB 4789.26-2013,但是随着食品工业技术的发展,要求执行商业无菌的食品种类越来越多,但传统的罐头商业无菌检验方法陈旧、程序烦琐、检验周期长,制约了罐头商业无菌检验,随着食品检验新技术的大力发展,商业无菌全自动微生物检测仪研发应用,已广泛应用于食品行业多种食品商业无菌检验,现以美国Charm商业无菌快速检测仪为例介绍自动化商业无菌设备的使用。
1.产品厂家及型号
厂家：美国Charm,型号：EPIC商业无菌快速检测仪。
2.工作原理及用途
Charm EPIC检测仪是一种全自动微生物检测仪。检测仪内预编有一整套程序用于检测成品中的微生物污染。细菌、酵母和霉菌等微生物细胞内都含有三磷酸腺苷(ATP)。Charm EPIC试剂会检测微生物细胞内的ATP,作为产品污染的指标。结果以相对发光单位(RLU)表示,结果显示为：合格,疑似阳性或不合格。检测结果也可用Charm EPIClink数据库软件进行分析。数据可以根据用户的需要用表格或图形格式统计。
EPIC系统可用于无菌、UHT或ESL乳制品、乳制品替代品和其他饮料产品。原味奶及风味奶、奶油(18%～40%)、冰激凌、椰奶、炼乳、半对半奶油(10.5%脂肪)、非奶奶油、牛奶糊、无乳糖奶、汤羹、豆奶、酸奶饮料、乳饮料、杏仁乳。
Charm验证的微生物种类：不动杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、硝基还原假单胞菌、米曲霉、巨大芽孢杆菌、聚团肠杆菌、英诺克李斯特菌、酿酒酵母、蜡样芽孢杆菌、耐热芽孢杆菌、粪肠球菌、荧光假单胞菌。
3.主要参数
3.1 仪器
LUM-EPIC-SYSTEM;EPIC荧光仪;PIP-50UL;50μl移液器。
3.2 试剂
EPIC-1000、EPIC试剂供1000次样品检测、EPIC-CTRL、日常质控试剂盒、EPIC-CLEAN日常清洁试剂盒、EPIC-MAINT系统维护试剂盒。
3.3 消耗品
EPIC-MP-96-50、空白96孔板、EPIC-MICROSTRIP-12日常质控微孔条(共3840孔)、EPICREMOVABLEWELL-HOLDER微孔条架(供日常质控用)、100-ULT-X1(96个枪头)、100-ULT-X5(960个枪头)、2～200μL移液器枪头。
4.操作规程
4.1 试剂准备
4.1.1 EPIC-ASE(ATP-降解酶,破坏游离ATP)
①一瓶试剂至少可进行200次测试。②拧松EPIC-ASE瓶盖子,小心拆卸和放置橡胶塞子。③拧松EPIC-ASE BUFFER瓶盖子,小心地把缓冲溶液倒入EPIC-ASE瓶中。丢弃空EPIC-ASE BUFFER瓶子和盖子。④用塞子塞住EPIC-ASE瓶,然后轻轻翻转10次至溶解。注意：不要摇动。⑤试剂复原溶解后,在室温(25℃以下)24 h内使用有效;若冷藏则可稳定48 h。
4.1.2 EPIC-X(微生物细胞裂解剂,裂解微生物细胞、释放胞内ATP)
①一瓶试剂至少可进行200次测试。②直接使用,无须配置。③试剂贮存在室温下(25°C或更低),一旦开瓶48 h内使用。
4.1.3 EPIC-LUM(荧光反应试剂,利用荧光素与荧光素酶与释放出的胞内ATP发生荧光反应)
①一瓶试剂至少可进行200次测试。拧松EPIC-LUM瓶盖子,小心拆卸和放置橡胶塞子。②拧松EPIC-LUM BUFFER瓶盖子,小心地把缓冲溶液倒入EPIC-LUM瓶中。丢弃空EPIC-LUM BUFFER。③瓶子和盖子。④用塞子塞住EPIC-LUM瓶,然后轻轻翻转10次至溶解。注意：不要摇动。⑤试剂复原溶解后,在室温(25℃以下)24 h内使用有效;若冷藏则可稳定48 h。样品检测前要将所有试剂回至室温(18℃～25℃)。
4.2 荧光仪准备
初始化分液器,装Drain Plate(废液板)到板架(Plate Carrier)内,用Reagent Water清洗三个分液器(每个洗20遍),用对应的试剂充填分液器(每个洗3遍)：①分液器A(红)=EPIC-X;②分液器B(蓝)=EPIC-ASE;③分液器C(绿)=EPIC-LUM。取出废液板,倒掉其中试剂。
4.3 产品微生物检测操作步骤
4.3.1 未开封的产品在30℃±2℃孵育36h或48 h(乳制品中的微生物能在孵育36 h后被检出,而非乳产品如豆奶、咖啡奶昔等需要30℃±2℃培养48 h),或对某一特定产品类型根据其他的预定时间和温度。在孵育期,确保包装盒间有足够的空气间隙。
4.3.2 摇晃包装,彻底混匀。
4.3.3 小心地打开包装,移取50μL样品到微孔板微孔中。
4.3.4 对所有要检测的样品都重复第2步和第3步。
4.3.5 把微孔板放到板架上。
4.3.6 在仪器软件主页面,点击“EPIC”。
4.3.7 输入plate ID、操作人、第一个样品孔的位置和样品数量等内容,然后点击“Start”。
4.3.8 开始后,EPIC荧光仪自动完成下列动作：
①在每个微孔中添加50μL的EPIC-ASE,孵育15 min。在这一步,ATP-降解酶消除非微生物来源的ATP。②在第一个待测微孔中添加95μL EPIC-X。EPIC-X试剂10 s内裂解微生物细胞、释放胞内ATP。③再往第一个待测微孔中添加95μL EPIC-LUM。2 s后测量荧光信号,单位为RLU(相对发光单位)。④所有余下的样品重复步骤b和c。
4.4 结果分析
Pass：RLU值<150表示没有微生物污染;(www.xing528.com)
Susp+：RLU值在151～300之间,表示可能受微生物污染(酵母、霉菌、和/或细菌);
Fail：RLU值>300表明有微生物污染。
“Pass”结果并不能保证包装是无菌的。一般来说,RLU读数越高表示微生物污染越严重。虽然微生物水平和RLU数之间存在相关性,但RLU和微生物平板计数之间没有线形相关性。所有阳性结果应该通过EPIC重新检测或标准微生物的方法进行确认。阴性质控：未孵育的UHT或ESL包装产品的样品可以作为阴性对照进行分析。用50μL未孵育的产品作为样品。性能监控：每天运行日常质控分析确保EPIC试剂和荧光仪的性能。EPIC日常质控试剂盒(单独供应)包括EPIC ATP阳性质控药片。请参考EPIC日常质控试剂盒中所提供阳性质控使用说明。
5.质控
EPIC日常质控试剂盒是用来校验荧光仪操作和试剂性能的。每天产品检测前,都要运行ATP阳性日常质控。
5.1 EPIC日常质控试剂盒包含：EPIC ATP阳性质控×60片、Reagent Water×7瓶、无菌小管×60个。
5.2 试剂储存
在室温(15℃～30℃)下保存Reagent Water,一旦开封需要冷藏。EPIC ATP阳性质控片冷藏密封保存在提供的箔衬袋中。
5.3 操作步骤
每天检测前,充填EPIC试剂后执行这个操作步骤：
5.3.1 加一片EPIC ATP阳性质控片到一个干净的无菌小管中。
5.3.2 加3 mL Reagent Water。
5.3.3 盖上盖子,剧烈摇动(或用涡旋振荡器)10 s,药片溶解时会起泡。
5.3.4 室温(15℃～30℃)静置5 min,再振动10 s。注意：ATP阳性质控溶液可以冷藏保存72 h。
5.3.5 取出6个ATP阳性质控试剂孔,放入A1-F1,把50μl,ATP阳性质控液加入C1,D1,E1和F1孔中。
5.3.6 选择ATP分析按键,输入Plate ID和Operator(操作人)。
5.3.7 把装有ATP阳性质控试剂孔的检测板放入板架,当板罩放下后,微孔自动调准位置。
5.3.8 选择Start键,3 min后得出阳性对照结果。其中A1和B1孔读数要小于35 RLU;C1和D1读数要小于150RLU;E1和F1读数要大于4000 RLU;检测后,荧光仪操作软件将自动报告结果。
6.设备的维护保养
6.1 EPICTM日常清洁简介：EPIC日常清洁试剂盒是一天的样品分析结束后或每24小时清洗EPIC荧光仪用的。根据EPIC荧光仪操作手册关于仪器操作的详细说明。包含：EPIC-Wash×30瓶、Reagent Water×60瓶。
6.2 操作步骤
6.2.1 从Utility下拉菜单中选择Dispensers,接下来Recover。
6.2.2 选择Injector A,B和C,选择3遍Stroke。
6.2.3 一旦试剂Recover后,把试剂瓶换成Reagent Water;然后冷藏替换下来的检测试剂。
6.2.4 选择Wash/Purge,选择Injector A,B和C,选择20遍Stroke。
6.2.5 把废液板放入板架;点击OK。
6.2.6 一旦Wash/Purge完成,要把废液板中的废液倒掉。
6.2.7 用EPIC-Wash瓶换掉Reagent Water瓶。
6.2.8 从Utility下拉菜单中选择Dispensers,点击Prime,选择Injector A,B和C,选择3遍Stroke。
6.2.9 Prime后倒掉废液板中的废液;可以关闭系统了。
6.3 储存
EPIC-wash：室温(15℃～30℃)下保存EPIC-wash。打开的EPIC-Wash要2℃～6℃冷藏保存。
Reagent Water：室温(15℃～30℃)下保存Reagent Water,打开的Reagent Water要2℃～6℃冷藏保存。
7.设备图片
图2-48 EPIC商业无菌快速检测仪
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