菌株保存方法及保藏期优化方案

菌种是一种重要的生物资源,菌种保藏是一切微生物工作的重要基础工作。其目的是运用物理、生物手段让菌种处于完全休眠状态,不死亡、不变异、不被杂菌污染,在长时间储存后仍能保持菌种原有生物特性和生命力,即保持其优良性状,以利于生产和科研应用。

微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡,因而常常造成菌种的衰退,并有可能使优良菌种丢失。菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定,确保菌种不死亡、不变异、不被污染,以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。

(一)菌种保藏的原理

为了达到长期保持菌种的优良特性,核心问题是必须降低菌种变异率,而菌种的变异主要发生于微生物旺盛生长、繁殖的过程,因此必须创造一种环境,使微生物处于新陈代谢最低水平,生长繁殖不活跃状态。一般来说通过降低基质含水量、降低培养基营养成分,或利用低温或降低氧分压的方法影响菌的呼吸、生长,新陈代谢,使其处于半休眠状态或全休眠状态,以显著延缓其菌种衰老速度,降低菌种发生变异的机会,从而使菌种保持良好的遗传特性和生理状态。

无论采用何种保藏方法,首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏,最好保藏它们的休眠体,如分生孢子、芽孢等。其次,应根据微生物生理、生化特点,人为地创造环境条件,使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧。另外,避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果。

菌种保藏的方法很多,其原理却大同小异,不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等,使微生物的代谢活动处于最低的状态,但又不至于死亡,从而达到保藏的目的。

(二)菌种保藏的方法

依据不同菌种的生理特性、不同的保存需求,采用不同的保存方法。

1.传代培养保藏法

又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等(保藏厌氧细菌用),培养后于4℃～6℃冰箱内保存。此方法为实验室日常工作菌株保存常用的方法。

(1)斜面低温保藏法

将菌种接种在适宜的斜面培养基上,待菌种生长完全后,置于4℃左右的冰箱中保藏,每隔一定时间(保藏期)再转接至新的斜面培养基上,生长后继续保藏,如此连续不断。此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右,无芽孢的细菌可保存1个月左右,酵母菌可保存3个月左右。如以橡皮塞代替棉塞,再用石蜡封口,置于4℃冰箱中保藏,不仅能防止水分挥发、能隔氧,而且能防止棉塞受潮而污染。这一改进可使菌种的保藏期延长。

该法的优点是简便易行,使用方便,不需特殊设备,容易推广,存活率高,能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等,故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。其缺点是容易变异,因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的,屡次传代会使微生物的代谢改变,而影响微生物的性状;且菌株仍有一定程度的代谢活动能力,保藏期短,传代次数多,菌种较容易发生变异,污染杂菌的机会亦较多。

方法：将纯菌种接种在适宜的固体斜面培养基上,待菌充分生长后,棉塞部分用油纸包扎好,移至2℃～8℃的冰箱中保藏。保藏时间依微生物的种类而有不同,霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2～4个月,移种一次。酵母菌两个月,细菌最好每月移种一次。

(2)半固体穿刺保存

将菌种穿刺接种在半固体培养基上,待菌种生长完全后,置于4℃左右的冰箱中保藏,每隔一定时间(保藏期)再转接至新的半固体培养基上,生长后继续保藏,如此连续不断,半固体保存菌种一般三个月转种一次为宜。

(3)石蜡油封藏法

液体石蜡覆盖保藏法：是传代培养的变相方法,能够适当延长保藏时间,它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡,一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡,另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。

此法是在无菌条件下,将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面(或半固体穿刺培养物)上,石蜡油层高出斜面顶端l cm,使培养物与空气隔绝,加胶塞并用固体石蜡封口后,垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。使用的液体石蜡要求优质无毒,化学纯规格,其灭菌条件是：150℃～170℃烘箱内灭菌l h;或121℃高压蒸汽灭菌60～80 min,再置于80℃的烘箱内烘干除去水分。　由于液体石蜡阻隔了空气,使菌体处于缺氧状态下,而且又防止了水分挥发,使培养物不会干裂,因而能使保藏期达1～2年或更长。这种方法操作简单,它适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等,对霉菌和酵母菌的保藏效果较好,可保存几年,甚至长达10年。但对很多厌氧性细菌的保藏效果较差,尤其不适用于某些能分解烃类的菌种。

2.载体保藏法

是将微生物吸附在适当的载体,如土壤、沙子、硅胶、滤纸上,而后进行干燥的保藏法,例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。

(1)土壤保存法

主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。方法是在灭菌的土壤中加入菌液,立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥,然后冷藏或在室温下密封保存。保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜,土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。

使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤(5 g)置于塞有棉塞的试管中,加水或加入充分稀释的液体培养基(以含水量为土壤最大持水量的60%为宜),然后高压灭菌。再将需保存的微生物进行大量接种,培养至菌丝能用肉眼确认的程度为止,移入干燥器中经短时间干燥或风干后密封,冷藏或室温保存。

(2)砂土保存法

取清洁的砂,过60目筛去掉大砂粒,并用磁铁吸去砂中铁屑,再用NaOH溶液、10%HCl溶液和水交替清洗数次,干燥后,置于试管或安瓿管中保持2～3 cm深,再经干热灭菌后,加入1 mL菌种培养液,经充分混匀后,放入真空干燥器中,完全干燥后熔封保存。也可用两份洗净的砂(经HCl预处理)和一份贫瘠、过筛的黄土掺和后灭菌,再进行菌种保藏。

(3)硅胶保存法

以6～16目的无色硅胶代替砂子,干热灭菌后,加入菌液。加菌液时,由于硅胶的吸附热常使温度升高,因而需设法加以冷却。

(4)磁珠保存法

将菌液浸入素烧磁珠(或多孔玻璃珠)后再进行干燥保存的一种方法。在螺旋口试管中装入1/2管高的硅胶(或无水CaSO4),上铺玻璃棉,再放上10～20粒磁珠,经干热灭菌后,接入菌悬液,最后冷藏、室温保藏或减压干燥后密封保藏。本法对酵母菌很有效,特别适用于根瘤菌,可保存长达两年半。

目前市场有成品的磁珠菌种冻存管出售,已在很多实验室广泛应用,磁珠菌种冻存管的使用方法如下：

无菌操作将新鲜培养的纯菌菌苔用接种环大量接入磁珠管中的液体中,一般使菌液浊度达到2～3个麦氏单位即可,接种环插入磁珠内部,搅匀磁珠,拧紧螺旋帽,反复颠倒摇匀磁珠管,使菌细胞吸附于磁珠上,然后弃去菌液,将磁珠管置于4℃冷藏保存即可。

(5)麸皮保存法

麸皮保存法亦称曲法保藏。即以麸皮作载体,吸附接入的孢子,然后在低温干燥条件下保存。其制作方法是按照不同菌种对水分要求的不同将麸皮与水以一定的比例1：(0.8～1.5)拌匀,装量为试管体积2/5,湿热灭菌后经冷却,接入新鲜培养的菌种,适温培养至孢子长成。将试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中,于室温下干燥数日后移入低温下保藏;干燥后也可将试管用火焰熔封,再保藏,则效果更好。此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌,保藏期在1年以上。因操作简单,经济实惠,工厂较多采用。中国科学院微生物研究所采用麸皮保藏法保藏曲霉,如米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉等,其保藏期可达数年至数十年。

3.寄主保藏法

用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物,如病毒、立克次氏体、螺旋体等,它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代,此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。

4.冷冻保藏法

适用于抗冻力强的微生物,这些微生物可在其菌体细胞外遭受冻结的情况下而不受损伤,而对其他大多数微生物而言,无论在细胞外冻结还是在细胞内冻结,都会对菌体造成损伤。

(1)注意事项

1)要选择适于冷冻干燥的菌龄细胞。

2)要选择适宜的培养基,因为某些微生物对冷冻的抵抗力常随培养基成分的变化而显示出巨大差异。

3)要选择合适的菌液浓度,通常菌液浓度越高,生存率越高,保存期也越长。

4)最好在菌液内不添加电解质(如食盐等)。

5)原则上应尽快进行冷冻处理,但当加入保护剂时,可静置一段时间后再进行保存。

6)就动物细胞而言,应在-20℃范围内以1℃/min左右的速度缓慢降温,此后必须尽快降到贮藏温度;而对绝大多数微生物而言,则不必如此,如结构较为复杂的原虫则可在-35℃范围内进行缓慢降温,而噬菌体则必须采用上述的二阶段法进行冷冻;若进行长期保存,则贮藏温度越低越好。

7)取用冷冻保存的菌种时,应采取速融措施,即在35℃～40℃温水中轻轻振荡使之迅速融解。而就厌氧菌来说,则应选择静置融化的措施。当冷冻菌融化后,应尽量避免再次冷冻,否则菌体的存活率将显著下降。

(2)冷冻保存法分类

1)低温冰箱(-20℃～-30℃,-50℃～-80℃)保存：低温冷冻保存时使用螺旋口试管较为方便,保存时菌液加量不宜过多,有些可添加保护剂(牛乳、二甲基亚矾)。

2)干冰酒精快速冻结(约-70℃)：即将菌种管插入干冰内,再置于冰箱内进行冷冻保存。

3)液氮(-196℃)冷冻保藏法：本方法是近年推广使用的一种菌种保存法。大多数微生物如病毒、噬菌体、立克次氏体、各种细菌、放线菌、支原体、各种丝状菌、酵母、藻类和原虫,特别是一些无法用冻干保存的微生物可用此法长期保存。工业微生物高产菌种也逐步采用此法保存。液氮保存的原理是微生物在-130℃以下温度时,它的新陈代谢作用停止,化学反应也消失,而液氮温度可达-196℃,在这种情况下可以长期保存。

有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液,以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢键和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲基亚矾等。

(3)冷冻保存法操作方法

1)准备用于液氮保藏的安瓿管,要求能耐受温度突然变化而不致破裂,因此,需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管,安瓿管的大小通常使用75×10 mm的。

2)加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时,则将空安瓿管塞上棉塞,1.05 kg/cm2,121.3℃灭菌15 min：若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如10%的甘油蒸馏水溶液或10%二甲基亚矾蒸馏水溶液,加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限,而后再用1.05 kg/cm2,121.3℃灭菌15 min。(www.xing528.com)

3)接入菌种：将菌种用10%的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液,装入已灭菌的安瓿管;霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器,从平板内切取菌落圆块,放入含有保护剂的安瓿管内,然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。

4)再将已封口的安瓿管以每分钟下降1℃的慢速冻结至-30℃。若细胞急剧冷冻,则在细胞内会形成冰的结晶,因而降低存活率。

5)将冻结至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器的小圆筒内,然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150℃,液态氮内为-196℃。

6)恢复培养保藏的菌种时,将安瓿管取出,立即放入38℃～40℃的水浴中进行急剧解冻,直到全部融化为止。再打开安瓿管,将内容物移入适宜的培养基上培养。

此法除适宜于一般微生物的保藏外,对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏,而且性状不变异。缺点是需要特殊设备。

5.冷冻真空干燥保藏法

冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法,简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中,再在极低温度(-70℃左右)下将菌样快速冷冻,并减压抽真空,在减压下利用升华现象使水升华,除去水分(真空干燥),将样品脱水干燥,形成完全干燥的固体菌块,并在真空条件下立即融封,造成无氧真空环境,与空气隔绝,以达到长期保存的目的。微生物具有容易变异的特性,因此在保藏过程中,必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态,才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力,因此融封好后最后置于低温下长期保藏。

为了防止在冷冻和水分升华过程中对细胞的损害,要采用保护剂来制备细胞悬液,使菌在冻结和脱水过程中起到保护作用的溶质,通过氢键和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。

此法制成的冻干制品呈海绵状、无干缩、复水性极好、含水分极少,可长时间保存和运输。此法保存的菌种使用时,可在无菌环境下开启安瓿管,将无菌的培养基注入安瓿管中,固体菌块溶解后,摇匀复水,然后将其接种于适宜该菌种生长的斜面上适温培养即可。

血清、菌种、中西医药等生物制品多为一些生物活性物质,真空冷冻干燥技术为保存生物活性物质提供了良好的解决途径。除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外,其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等各类微生物均可采用这种保藏方法,不宜用冻干法保存的微生物不到2%。

(1)菌株真空冷冻干燥保藏法的用途

1)干燥保存易脱水的产品,在加水以后能够再次恢复原材料的特性,不影响其生物活性等;在非常低温的状态下达到干燥,蛋白质保持无水,而其他主要的化学键保持 质的量不变。

2)通过冷冻干燥使组织、组织提取物、细菌、疫苗及血浆之类的材料成为干燥状态,从而不会发生酶的、细菌的及化学的改变。

3)冷冻干燥是使组织保存生物特性敏感性的最佳方法。

(2)试验步骤

1)安瓿管准备

选取规格约直径为8 mm、高100 mm的中性玻璃安瓿管,先用2%盐酸浸泡8～10 h,再经自来水涮洗多次,用蒸馏水冲洗2到3次,烘干,在每管内放入打好菌号及日期的标签,字面朝向管壁,管口塞好棉塞,灭菌备用。

2)保护剂的选择及制备

冷冻干燥保藏法使用的保护剂种类很多,效果不尽相同,通常采用高分子化合物与低分子化合物混合使用效果更好。在配制时注意比例、浓度、pH和灭菌方法。一些对热敏感的保护剂如血清等用过滤除菌,牛奶、葡萄糖及乳糖等要控制灭菌温度。一般情况下多数菌种可以用脱脂乳糖为保护剂。

3)菌种准备及分装

菌种要求为生长良好的纯种,菌龄以处于稳定期为好,孢子是新鲜的。每支长好的斜面加2～3 mL保护剂,用接种环将菌苔轻轻刮起(注意勿刮起培养基)制成菌悬液。如用液体培养的菌种则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细胞。收集菌体,用保护剂悬浮制成菌悬液。悬液中菌数要求达到109～1010 CFU/mL为宜。悬液制备完成尽快分装和冻结。分装安瓿时可用灭菌的长滴管插入安瓿管底部,分装量可依据冷冻干燥机效能而定。

4)预冻

分装好的安瓿管需要进行预冻,即放在-30℃到-40℃下冻结20～60 min,也可以用干冰和无水乙醇冻5～10 min。

冷冻干燥：将预冻的安瓿管放入干燥箱中开始抽真空干燥。此时干燥箱温度控制在-30℃以下并尽快使真空度达到66 Pa以下。此后可逐渐升温以加速水分升华,但升温不宜过快,以免引起样品融化。干燥时间视冻干机效率、样品装量及性质等而定,以样品最终水分含量达到1%～3%为准。具体操作时是根据冻干样品呈酥块松散片,真空度接近空载时最高真空,样品温度与管外温度接近,干燥完毕将安瓿管在真空下用火焰烧熔密封,并用高频真空检测真空度。

5)保藏

密封好的冻干管在4℃或-18℃下保藏。

6)冻干管的启用

当需用冻干菌种时,取出安瓿管用酒精表面消毒,用小砂轮在无菌条件下打开,或将安瓿管顶部在酒精灯火焰上灼烧,迅速滴上冷的无菌水使管破裂,然后用镊子等轻轻敲碎管口,加入0.3～0.5 mL液体培养基溶解冻干菌块成为悬液,用无菌滴管或接种环移至斜面或液体培养基进行培养。

(3)冷冻干燥注意事项

1)冷冻干燥前的培养条件

首先检验菌种纯度。一般地说,将待保存的微生物在营养丰富且容易增菌的培养基上进行培养为宜;菌龄以达到对数生长期为好;若为有芽孢或孢子的微生物,则以芽孢和孢子形成以后进行保存为好;菌液浓度以高为好,如细菌应达到109～1010 CFU/mL。

2)菌株号码等的标记

在安瓿瓶内封入菌株标签,以防丢失菌株编号。

3)安瓿瓶的要求

将安瓿瓶在2% HCl中浸泡过夜,自来水冲洗3次后,蒸馏水冲洗干净,自然干燥,塞棉塞,贴标签,干热灭菌或湿热灭菌后,60℃恒温干燥。

4)添加保护剂

常用的保护剂有脱脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉汤以及加7.5%葡萄糖的血清等等。

(4)影响预存菌株生长的因素

1)菌的质量

保藏的菌种应培养在营养丰富的最适条件下使之进入稳定期,稍老一些的菌体对环境抵抗力强。另外,作为冷冻干燥的菌悬液细胞浓度要高,不同的菌对冷冻干燥的耐受程度不同,如果保存的菌液细胞浓度不高,就会使以后传种造成困难,保存期也会受到影响。

2)保护剂

不同种类的保护剂对不同微生物的作用是不同的,如个别菌种在脱脂乳作保护剂的情况下死亡率高达99.99%,而采用葡聚糖等混合保护剂时死亡率大大减少。一般情况下,那些容易保存的菌种对保护剂的要求不很严格,而不易保存的菌种对保护剂的要求却很苛刻。因此选择好的保护剂是冷冻干燥保存菌种的关键因素。

3)干燥速度

实验表明慢速干燥比快速干燥存活率高,如青霉菌6 h干燥存活率为67.3%,而3 h为59%。

4)空气的影响

冷冻干燥后空气对细菌细胞影响较大,可导致细胞损伤进而死亡,故在冻干后应立即在真空下融封才有利于长期保存。

5)温度的影响

在干燥和真空状况下,温度的影响远没有上述几项因素重要,因此可以在室温下保存,但许多微生物在4℃保存的存活率要比在室温下高1倍。

6)含水量的影响

水分含量过高对菌存活不利,完全脱水也不利于保存,一般把干燥后的细胞含水量控制在合适的范围内,菌悬液细胞浓度要高,不同的菌对冷冻干燥的耐受程度不同,如果保存的菌液细胞浓度不高,就会使以后传种造成困难,保存期也会受到影响。

7)复苏培养

打开安瓿管后加入无菌水使冻干菌融化,融化速度慢比快速融化的成活率要高。菌种能否适宜于冻干保存,需经过实验来证明,一般是在保存1个月进行复苏培养,如果菌的成活率高于10%,即认为可用冻干保存法保存,以后6个月、2年、5年、10年再进行检查存活情况,以确定保存期的上限。冻干保藏的效果因微生物种类而异,一般是细菌>放线菌>真菌>藻类,而菌丝体不宜用此法保存。

由于此法是同时兼具低温、干燥、除氧三方面的保藏条件保藏菌种,因此保藏期长,一般达5～15年,变异率低,存活率高;此法还具有体积小、不易污染、便于运输等其他干燥方法无可比拟的优点,因此该技术问世以来越来越受到人们的青睐,在医药、生物制品和食品方面的应用已日益广泛,是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法,因此大多微生物实验室运用菌株真空冻干系统进行菌株的保存,为实验室后续的研究工作提供菌种资源。菌株真空冻干系统进口品牌有丹麦阿特拉斯、德国Christ、德国SRK、美国EDWARDS、德国CHRIST、德国芬纳夸、日本共和;国产品牌有上海东富龙、沈阳新阳、西安德派的、北京天利、厦门利马、大连冰山等。以下内容将介绍菌株真空冻干系统的标准操作程序。