菌落计数方法详解

(一)菌落计数方法

食品微生物计数方法主要有：显微镜直接计数法、平皿菌落总数测定法、最近似数测定法、还原实验法、其他方法。

检测食品中微生物数量的微生物意义：可作为食品被微生物污染程度的标志,也可用于预测食品贮存期限(保质期)。食品中细菌总数还能反映食品的新鲜程度、是否发生变质。理想的检测方法是对所有食品都适用,并在短时间内获得准确结果。实际上至今还没有一种通用的方法能准确测出食品中的实际活菌数,都有一定的误差、使用范围和优缺点。

1.显微镜直接计数法(DMC)

(1)直接涂片计数法

将0.01 mL经适当稀释的样品均匀涂布于载玻片上的1 cm2面积的方格内,经干燥、固定、革兰氏染色后,用显微镜观察技术。

在技术钱先用物镜测微尺测出油镜视野的直径,再观察计算10-15个视野的细菌总数,求出平均数。

r——显微镜油镜视野的半径(mm)

B——稀释倍数

特点：操作简便、快捷;不能区分活菌与死菌,计数结果偏高,只适用于细菌较高的样品;只适用于计数单细胞的微生物。

(2)血球计数板计数法(如图2-44)

将适当稀释的样品注入血球板的计数室中。由于计数室的容积是已知的(0.1 mm3),计算一定微小体积内的菌数,即可计算出每克或每毫升样品中的菌数。

图2-44　血球计数板计数法

菌体细胞数(CFU/mL)=小格内平均菌体细胞数×400×104×稀释倍数。

特点：操作简便、快速,可在十分钟内得到结果。待测标本未经火焰固定杀死细胞,故所测结果为活菌数。此法适用于计数单细胞的酵母菌。

2.平皿菌落计数测定法

平皿菌落总数测定法是最常用的一种活菌计数法,也是我国卫生标准规定的公认可行的方法,因此又称标准平皿活菌计数法(图2-45)。具体操作参见GB 4789的内容。(www.xing528.com)

图2-45　菌落计数平皿

平皿菌落总数测定法,除了菌落总数外,还用于食品中大肠菌群、霉菌酵母、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的定量检测,食品检样经过处理,在一定条件下(如培养基、培养温度和培养时间等)培养后,所得每g(mL)检样中形成微生物菌落总数。平皿菌落计数测定法分为两种：

倾注平板法：被检样品用生理盐水磷酸缓冲液进行无菌稀释,做成几个适当稀释倍数的悬液,选择2～3个适当稀释度悬液各1 mL,加入无菌空培养皿内,每个稀释度做2～3各培养皿,每个培养皿中倾注约15 mL融化冰冷却到46℃左右的平板计数琼脂培养基,冷却后,放于36℃培养48 h后进行菌落计数后报告结果。

涂布平板法：先到平板,待其凝固后,吸取0.1 mL稀释液与平板表面上,用无菌涂布棒在整个平板上均匀涂布,培养观察。优缺点：菌落形态比较明显,更适合于严格的好氧菌,但是没有倾注法简便,易造成机械损伤。

菌落计数可用肉眼观察(直接、放大镜)或利用自动影像分析菌落计数仪。

3.最近似数测定法(most probable number MPN)

MPN法,即最可能数,基于泊松分布的一种简洁计数方法。对待检样品做连续的10倍稀释,选择3个连续的10倍稀释液,每种稀释液接种3管(5管)装有培养基的试管中培养,根据实验结果查MPN检索表,得到样品中微生物的数量。根据经确证后的对应浓度阳性管数查MPN表。具体参见GB 4789的内容。优点：操作简便,与平板计数法相比,相似率较高,采用选择性培养基可检测微生物菌群,特别适用于监测食品内含菌量较少的样品。缺点：需要大量的玻璃器皿,不能观察微生物菌落形态,要注意严格的无菌操作。

4.测试片法

根据平板计数法的原理,很多厂家研发了很多测试片,是以纸片、纸膜、胶片等作为培养基载体,将特定的培养基和显色物质附着在上面,通过微生物在上面的生长、显色来测定食品中微生物的方法,是一种集化学、高分子学和微生物学于一体的检测方法。目前已应用于食品、饮用水及原料中菌落总数、大肠菌群、大肠杆菌、乳酸菌、霉菌和酵母菌、金黄色葡萄球菌等的计数检测。

快速测试片检测的优点：第一,快速测试片可测定少量检品,不需要配制试剂,不需要大量的玻璃器皿,操作简便迅速;易于消毒保存,便于运输,携带方便,价格低廉,加之除纸片外无其他任何废液废物,大大减少或消除对环境的污染,以及试验后的清洗工作,减少了工作量。另外,避免了热琼脂法不适宜受损细菌恢复的缺陷,故适用于实验室、生产现场和野外环境工作使用。第二,快速测试片可以在取样时同时接种,结果更能反映当时样本中真实的细菌数,防止延长接种时间时由于细菌繁殖造成的数量增多。第三,常规法一般需要时间较长,而且要特定的温度,这样导致许多基层单位和食品企业不能实施,也不能达到及时检测的目的。而测试片无须进行使用前的准备工作,大大缩短了时间。

快速测试片检测的缺点：用滤纸作载体,滤孔过大,导致滤纸双面都有菌落生长而无法计数;滤纸保水性差,检验培养中又不能保持湿度充分,不利于菌体生长;滤纸检验卡存在营养物质分布不均匀的问题,加样也不能迅速扩散,导致菌体生长分布不均匀;另外,由于显色指示剂系统单一,不能对细菌有区别地计数,真菌会更差,所以很难全面推广。Petrifilm测试片上覆盖一层薄膜,当细菌产气、产黏液过多时会出现菌落的扩散和融合,影响计数;Petrifilm测试片面积较小,当菌量大于250 CFU时,准确计数较困难;待测样品中含有的某些有机物可能使显色减缓,使目视效果下降,导致计数偏低;另外,培养基吸水比较缓慢,如果在未分布均匀前用力挤压,会使稀释液体从边缘流出,从而影响结果。

5.还原实验法

还原实验法是一种估计活性微生物数量的方法。原理是微生物细胞在进行生物代谢的氧化还原过程中,有的被氧化,有的被还原,测定还原能力即可推测样品内的菌数。某些指示剂和色素可反应这个变化,这些成分的还原时间同细菌数量呈反比。常用的染料有三种,美蓝：蓝色被还原为无色,刃天青：蓝色被还原为粉红色或无色,红四氮唑：无色被还原为粉色或红色。应用于乳品工业上原料乳中的微生物检测,优点：简便、快捷、经济。缺点：所得结果不够准确,不适用于含有还原性酶的食品。

6.浊度测量法

利用浊度计或分光光度计测定培养液中微生物的生长量。当某一波长的光线通过混浊的液体后,光的强度被减弱。因为菌体不透光,在一点光浓度范围内,悬液中单细胞的数量与光密度(OD值)成正比。当细菌浓度达到107 CFU/mL时,培养基会浑浊。优点：样品数量较多时,此法与SPC方法相比省时省力。缺点：若样品颜色较深或含有固体颗粒时,不宜采用。

(二)菌落计数设备的使用

菌落计数器是利用图像采集器采集图像,通过计算机对图像进行分析,自动计数和测量细菌在固体培养基上生长而形成的肉眼可见的菌落或菌斑,广泛用于食品,饮料,药品,生物制品,化妆品,卫生用品,饮用水,生活污水,工业废水,临床标本中细菌数的检验。目前市场上在售的国产品牌有上海产的TYJS-II型菌落计数器,进口品牌有美国Charm Sciences INC公司的全自动菌落计数器。