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微生物形态学鉴定的方法和步骤

时间:2023-06-30 理论教育 版权反馈
【摘要】:形态学鉴定主要包括菌落形态和个体形态观察两方面。由于每一大类微生物都有其独特的细胞形态,因而其菌落形态特征也各异。在四大类微生物的菌落中,细菌和酵母菌的形态较接近,放线菌和霉菌形态较相似。

微生物形态学鉴定的方法和步骤

形态学鉴定主要包括菌落形态和个体形态观察两方面。

1.菌落形态的识别

菌落是由某一微生物的少数细胞或孢子在固体培养基表面繁殖后所形成的子细胞群体,因此,菌落形态在一定程度上是个体细胞形态和结构在宏观上的反映。由于每一大类微生物都有其独特的细胞形态,因而其菌落形态特征也各异。在四大类微生物的菌落中,细菌酵母菌的形态较接近,放线菌霉菌形态较相似。掌握识别四大类微生物菌落形态的要点对于从事菌种的筛选、杂菌的识别和菌种鉴定等项工作都有重要意义。

(1)细菌和酵母菌的异同

细菌和多数酵母菌都是单细胞微生物。菌落中各细胞间都充满毛细管水、养料和某些代谢产物,因此,细菌和酵母菌的菌落形态具有类似的特征,如湿润、较光滑、较透明、易挑起、菌落正反面及边缘、中央部位的颜色一致,且菌落质地较均匀等。它们之间的区别如下:

细菌:由于细胞小,故形成的菌落也较小,较薄、较透明且有“细腻”感。不同的细菌会产生不同的色素,因此常会出现五颜六色的菌落。此外,有些细菌具有特殊的细胞结构,因此,在菌落形态上也有所反映,如无鞭毛不能运动的细菌其菌落外形较圆而凸起;有鞭毛能运动的细菌其菌落往往大而扁平,周缘不整齐,而运动能力特强的细菌则出现更大、更扁平的菌落,其边缘从不规则、缺刻状直至出现迁居性的菌落,例如变形杆菌属和菌种。具有荚膜的细菌其菌落更黏稠、光滑、透明。荚膜较厚的细菌其菌落甚至呈透明的水珠状。有芽孢的细菌常因其折光率和其他原因而使菌落呈粗糙、不透明、多皱褶等特征。细菌还常因分解含氮有机物而产生臭味,这也有助于菌落的识别。

酵母菌:由于细胞较大(直径约比细菌大10倍)且不能运动,故其菌落一般比细菌大、厚而且透明度较差。酵母菌产生色素较为单一,通常呈矿蜡色,少数为橙红色,个别是黑色。但也有例外,如假丝酵母因形成籍节状的假菌丝,故细胞易向外圈蔓延,造成菌落大而扁平和边缘不整齐等特有形态。酵母菌因普遍能发酵含碳有机物而产生醇类,故其菌落常伴有酒香味。

(2)放线菌和霉菌的异同

放线菌和霉菌的细胞都是丝状的,当生长于固体培养基上时有营养菌丝(或基内菌丝)和气生菌丝的分化。气生菌丝向空间生长,菌丝之间无毛细管水,因此菌落外观呈干燥、不透明的丝状、绒毛状或皮革状等特征。由于营养菌丝伸入培养基中使菌落和培养基连接紧密,故菌丝不易被挑起。由于气生菌丝、孢子和营养菌丝颜色不同,常使菌落正反面呈不同颜色。丝状菌是以菌丝顶端延长的方式进行生长的,越近菌落中心的气生菌丝其生理年龄越大,也越早分化出子实器官或分生孢子,从而反映在菌落颜色上的变化,一般情况下,菌落中心的颜色常比边缘深。有些菌的气生菌丝还会分泌出水溶性色素并扩散到培养基中而使培养基变色。有些菌的气生菌丝在生长后期还会分泌水滴,因此,在菌落上出现“水珠”。

放线菌:放线菌属原核生物,其菌丝纤细,生长较慢,气生菌丝生长后期逐渐分化出孢子丝,形成大量的孢子,因此菌落较小,表面呈紧密的绒状或粉状等特征。由于菌丝伸入培养基中常使菌落边缘的培养基呈凹状。不少放线菌还产生特殊的土腥味或冰片味。

霉菌:霉菌属真核生物,它们的菌丝一般较放线菌粗(几倍)且长(几倍至几十倍),其生长速度比放线菌快,故菌落大而疏松或大而紧密。由于气生菌丝会形成一定形状、构造和色泽的子实器官,所以菌落表面往往有肉眼可见的构造和颜色。

2.微生物形态学检查

细菌个体微小,且较透明,必须借助染色法使菌体着色,显示出细菌的一般形态结构及特殊结构,在显微镜下用油镜进行观察。根据细菌个体形态观察的不同要求,可将染色分为简单染色、鉴别染色和特殊染色。细菌形态学检查是细菌检验的重要方法之一,它是细菌分类和鉴定的基础,可根据其形态、结构和染色反应性等,为进一步鉴定提供参考依据。

(1)显微镜检查

由于细菌个体微小,肉眼不能看到,必须借助显微镜的放大才能看到。一般形态和结构可用光学显微镜观察,其内部的超微结构则需用电子显微镜才能看清楚。常用显微镜有如下几种。

1)普通光学显微镜 采用自然光或灯光为光源,其波长约为400~700 nm。显微镜的分辨率为0.2μm,而肉眼可见的最小形象为0.2 mm。故用油(浸)镜放大1000倍,能将0.2μm的微粒放大成肉眼可见的0.2 mm。普通光学显微镜可用于细菌、放线菌和真菌等的观察。

2)暗视野显微镜 常用于观察不染色微生物形态和运动。在普通显微镜安装暗视野聚光器后,光线不能从中间直接透入,视野呈暗色,当标本接受从聚光器边缘斜射光后可发生散射,因此可在暗视野背景下观察到光亮的微生物如细菌或螺旋体等。

3)相差显微镜 相差显微镜利用相差板的光栅作用,改变直射光的光位相和振幅,将光相的差异转换为光强度差。在相差显微镜下,当光线透过不染色标本时,由于标本不同部位的密度不一致而引起光相的差异,可观察到微生物形态、内部结构和运动方式等。

4)荧光显微镜 荧光显微镜与普通光学显微镜基本相同,主要区别在于光源、滤光片和聚光器。目前大多数使用的是落射光装置,常用高压汞灯作为光源,可发出紫外光或蓝紫光。滤光片有激发滤光片和吸收滤光片二种。用蓝光的荧光显微镜除可用一般明视野聚光器外,也可用暗视野聚光器,以加强荧光与背景的对比。本法适用于对荧光色素染色或与荧光抗体结合的细菌的检测或鉴定。

5)电子显微镜 用电子流作为光源,波长与可见光相比差几万倍,大大提高了分辨力,并用磁性电圈作为光学放大系统,放大倍数可达数万倍或几十万倍,常用于病毒颗粒和细菌超微结构的观察。

(2)不染色标本检查

不染色标本一般可用于观察细菌形态、动力及运动情况。细菌未染色时无色透明,在显微镜下主要靠细菌的折光率与周围环境的不同来进行观察。有鞭毛的细菌运动活泼,无鞭毛的细菌则呈不规则布朗运动梅毒苍白密螺旋体、钩端螺旋体、弯曲杆菌等的活菌各有特征鲜明的形态和运动方式,具有诊断意义。常用的方法有压滴法、悬滴法和毛细管法等。

1)悬滴法在洁净凹玻片的凹孔四周涂上凡士林,用接种环取一环菌悬液放在盖玻片中央,再将凹玻片的凹孔对准盖玻片中央的液滴并盖上,然后迅速翻转,轻压盖玻片,使其与凹孔边缘的凡士林粘紧封闭后置高倍镜下(或暗视野)观察。

2)压滴法用接种环取一环菌悬液置于洁净玻片的中央,在菌悬液上轻轻盖上一盖玻片,注意避免产生气泡并防止菌悬液外溢,静止数秒钟后置高倍镜下明视野(或暗视野)观察。

3)毛细管法主要用于厌氧菌动力的检查。通常选用60~70 mm长、0.5~1.0 mm孔径的毛细管虹吸厌氧菌悬液后,用火焰将毛细管两端熔封。并用塑胶纸将毛细管固定在载玻片上,置高倍镜下暗视野观察。

(3)染色标本检查

细菌标本经染色后,由于细菌与周围环境间在颜色上形成鲜明对比,故在普通光学显微镜下可清楚地观察到细菌的形态特征(如细菌的大小、形状、排列等)和某些特殊结构(如荚膜、鞭毛、芽孢等),并可根据染色反应对细菌加以分类鉴定。

细菌染色的一般程序是:涂片(干燥)→固定→染色(媒染)→(脱色)→(复染)。

①涂片:制备血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液体培养物,直接在载玻片上作薄膜涂片;尸检或感染动物组织,病变局部涂抹采样的棉拭子直接涂片。固体培养基上的菌落或菌苔的制片,先用接种环取一环生理盐水置载玻片中央,再用无菌接种环取少量的培养物在生理盐水中磨匀,涂布成1 cm2大小的涂面,置室温下自然干燥或远火慢慢烘干。

②固定:目的是杀死细菌,凝固细菌蛋白及结构,便于染色;促使细菌粘附在载玻片上,避免在水洗过程中被水冲掉;改变细菌对染料的通透性,有利于菌细胞内结构的染色。通常用火焰加热固定,将已干燥的涂片在火焰中迅速通过3次,以手背皮肤接触玻片不烫为佳。

③染色:根据检验目的不同,选择不同的染色方法进行染色。染色时滴加染液,以覆盖标本为度。

④媒染:凡能增强染料和被染物的亲和力,使染料固定于被染物及能引起细胞膜通透性改变的物质,称媒染剂。常用的有明矾、鞣酸、金属盐和碘等,也有用加热法促进着色。媒染剂可用于初染与复染之间,也可用于固定之后或含于固定液、染色中。

⑤脱色:凡能使已着色的被染物脱去颜色的化学试剂称为脱色剂。常用乙醇丙酮等作为脱色剂。脱色剂可以查出细菌与染料结合的稳定程度,作为鉴别染色之用。

⑥复染:已脱色处理的细菌或其结构常以复染液作复染以便于观察。复染液与初染液的颜色不同而成一鲜明对比。复染不宜太强,以免掩盖初染的颜色。

(4)常用染色法

1)单染色法:只用一种染料染色。由于大多数细菌胞浆内含有酸性物质,可与碱性染料结合,故常用吕氏美蓝、结晶紫和稀释石碳酸复红等染液。此法可观察细菌的大小、形态与排列,不能显示细菌的结构与染色特性。(www.xing528.com)

2)复染色法:用两种或两种以上不同染料可将细菌染成不同的颜色,除可观察细菌的大小、形态与排列外,还反映出细菌染色特性,具有鉴别细菌种类的价值。常用的有革兰染色法和抗酸染色法。

①革兰染色:

A.细菌涂片经火焰固定,加结晶紫染液染1 min,清水冲去染液。

B.加碘液媒染1 min,水洗,甩干。

C.用95%乙醇脱色,轻轻摇动约30 s,至无紫色洗落为止,水洗,甩干。

D.加稀释石碳酸复红或沙黄染液数滴进行复染,约30 s,水洗。

E.干后显微镜下镜检观察结果,革兰阳性菌染成紫色,革兰阴性菌为红色。

②抗酸染色:萋-尼(Ziehl-Neelse)抗酸染色法:

A.细菌涂片经火焰固定,加石炭酸复红溶液,徐徐加热至有蒸气出现,切不可沸腾。染液因蒸发减少时,应随时补充,防止染液蒸干。持续染5 min(奴卡菌需要加长时间),水洗,甩干。

B.滴加3%盐酸乙醇脱色,不时摇动玻片至无红色脱落为止,水洗,甩干。

C.加吕氏美蓝复染液数滴复染1 min,水洗。

D.干后显微镜下镜检观察结果,抗酸杆菌染成红色,非抗酸杆菌为蓝色。

③金胺O-罗丹明B染色法:

A.细菌涂片固定后加第1液30~90 s。

B.弃去第1液后加第2液染15 min。

C.用第3液脱色1~2 min,水洗。

D.滴加第4液染30 s,水洗。

E.干后置荧光显微镜下镜检观察结果在淡蓝色背景下,抗酸杆菌呈红色,其他细菌和细胞呈蓝色。

3)特殊染色法

①鞭毛染色(改良Ryu法):

A.玻片的处理将新载玻片浸泡在95%乙醇中。临用时取出,以干净纱布擦干。

B.在玻片上滴蒸馏水1滴。

C.挑取培养物少许,轻触蒸馏水滴顶部,仅允许极少量细菌进入水滴,不可搅动,以免鞭毛脱落。

D.置35℃孵箱自然干燥,不能用火焰固定,滴加鞭毛染液染1~2 min轻轻水洗。

E.干后显微镜镜检观察结果鞭毛和菌体呈紫色。

②异染颗粒染色(阿尔培托法):

A.细菌涂片经火焰固定,加甲液染色3~5 min。水洗。

B.滴加乙液,染1 min。水洗。

C.干后显微镜镜检观察结果菌体呈绿色,异染颗粒呈蓝黑色,用于白喉棒状杆菌染色。

③荚膜染色:

A.奥尔特荚膜染色法:将已固定的细菌涂片滴加3%沙黄染液,用火焰加温染色,持续3 min,冷却后水洗,待干镜检。结果:菌体呈褐色,荚膜呈黄色,此法主要用于炭疽芽孢杆菌。

B.Hiss氏硫酸铜法:染液:第一液为结晶紫乙醇饱和液5 mL加蒸馏水95 mL的混合液;第二液为20%硫酸铜水溶液。方法:细菌涂片自然干燥,乙醇固定。滴加第一液,微加热染1 min。再用第二液将涂片上的染液洗去,勿再水洗,倾去硫酸铜液,以吸水纸吸干镜检。结果:菌体及背景呈紫色,荚膜呈鲜蓝色或不着色。

④芽孢染色:染液,第一液为萋纳氏石炭酸复红液,第二液为95%乙醇,第三液为碱性美蓝液。方法:将已固定的细菌涂片滴加第一液,微加热染5 min,冷却后水洗。用第二液脱色2 min,水洗。加第三液复染1 min,水洗,待干镜检。结果:菌体呈蓝色,芽孢呈红色。

4)负染色法:背景着色而菌体本身不着色的染色为负染色法。最常见的是墨汁负染色法,用来观察真菌及细菌荚膜等。在标本涂片处滴加染液,混合后加上盖玻片(勿产生气泡),轻压。在低倍镜下寻找有荚膜的菌细胞,转高倍镜或油镜确认,如新型隐球菌可见宽厚透亮的荚膜,背景为黑色。

5)荧光染色法:经荧光素染色的细菌,或荧光素标记的荧光抗体与相应抗原的细菌、病毒结合形成的复合物,在荧光显微镜下发出荧光。

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