细菌培养方法及设备概述

微生物的生长,除了受本身的遗传特性决定外,还受到许多外界因素的影响,如营养物浓度、温度、水分、氧气、pH等。微生物的种类不同,培养的方式和条件也不尽相同。

1.影响微生物生长的因素

微生物的生长,除了受本身的遗传特性决定外,还受到外界许多因素的影响。影响微生物生长的因素很多,简要介绍如下。

(1)营养物浓度

细菌的生长率与营养物的浓度有关：μ=μmax*C/(K+C),营养物浓度与生长率的关系曲线是典型的双曲线。

K值是细菌生长的很基本的特性常数。它的数值很小,表明细菌所需要的营养浓度非常之低,所以在自然界中,它们到处生长。然而营养太低时,细菌生长就会遇到困难,甚至还会死亡。这是因为除了生长需要能量以外,细菌还需要能量来维持它的生存。这种能量称为维持能。另一方面,随着营养物浓度的增加,生长率愈接近最大值。

(2)温度

在一定的温度范围内,每种微生物都有自己的生长温度三基点：最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度。在生长温度三基点内,微生物都能生长,但生长速率不一样。微生物只有处于最适生长温度时,生长速度才最快,代时最短。超过最低生长温度,微生物不会生长,温度太低,甚至会死亡。超过最高生长温度,微生物也要停止生长,温度过高。也会死亡。一般情况下,每种微生物的生长温度三基点是恒定的。但也常受其他环境条件的影响而发生变化。

根据微生物最适生长温度的不同,可将它们分为三个类型：嗜冷微生物：其最适生长温度多数在-10℃～20℃之间;中温微生物：其最适生长温度一般在20℃～45℃之间;嗜热微生物：生长温度在45℃以上。

(3)水分

水分是微生物进行生长的必要条件。芽孢、孢子萌发,首先需要水分。微生物是不能脱离水而生存的。但是微生物只能在水溶液中生长,而不能生活在纯水中。各种微生物在不能生长发育的水分活性范围内,均具有狭小的适当的水分活性区域。

(4)氧气

按照微生物对氧气的需要情况,可将它们分为以下五个类型。

1)需氧微生物：这类微生物需要氧气供呼吸之用。没有氧气,便不能生长,但是高浓度的氧气对需氧微生物也是有毒的。很多需氧微生物不能在氧气浓度大于大气中氧气浓度的条件下生长。绝大多数微生物都属于这个类型。

2)兼性需氧微生物：这类微生物在有氧气存在或无氧气存在情况下,都能生长,只不过所进行的代谢途径不同罢了。在无氧气存在的条件下,它进行发酵作用,例如酵母菌的无氧乙醇发酵。

3)微量需氧微生物：这类菌是需要氧气的,但只在0.2大气压下生长最好。这可能是由于它们含有在强氧化条件下失活的酶,因而只有在低压下作用。

4)耐氧微生物：这类微生物在生长过程中,不需要氧气,但也不怕氧气存在,不会被氧气所杀死。

5)厌氧微生物：这类微生物在生长过程中,不需要分子氧。分子氧存在对它们生长产生毒害,不是被抑制,就是被杀死。

2.培养方法

根据培养时是否需要氧气,可分为需氧培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法三大类。培养箱是培养微生物的主要设备,可用于细菌、细胞的培养繁殖。其原理是应用人工的方法在培养箱内造成微生物和细胞、细菌生长繁殖的人工环境,如控制一定的温度、湿度、气体等。目前根据细菌生理特性,培养方式及培养设备主要分为三种：生化培养箱、二氧化碳培养箱和直接电热式培养箱。目前市场上在售的进口产品主要有日本三洋、德国IMMM Friocell系列、德国Labotect等、德国Binder、英国RS Biotech公司Galaxy系列、美国Thermo。国产培养箱有上海博迅,上海培因,上海力康、上海览浩。

(1)需氧培养法

也称“好氧培养”。就是说这种微生物在培养时,需要有氧气加入,否则就不能生长良好。在实验室中,斜面培养是通过棉花塞从外界获得无菌的空气。三角烧瓶液体培养多数是通过摇床振荡,使外界的空气源源不断地进入瓶中。本法是微生物培养最常用的培养方法,适于一般需氧和兼性厌氧菌的培养。将已接种好的平板、斜面和液体培养基等,置于35℃温箱中孵育18～24 h,一般细菌可于培养基上生长,但有些难以生长的细菌需培养更长的时间才能生长。另外,有的细菌最适生长温度是28℃～30℃,如鼠疫耶尔森菌,有的甚至在4℃也能生长,如李斯特菌。用到的培养设备是生化培养箱、恒温恒湿培养箱、直接电热式培养箱。

(2)二氧化碳培养法

有些细菌初次分离培养时须置5%～l0% CO2环境才能生长良好,如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌,牛布鲁菌等。常以下列方法供给CO2。

1)烛缸法：将已接种好的培养基置干燥器内,并放入点燃的蜡烛。干燥器盖的边缘涂上凡士林,盖上盖子,烛光经几分钟后自行熄灭,此时干燥器内CO2含量约占5%～l0%,然后将干燥器放入35℃温箱内培养。培养时间一般为18～24 h,少数菌种需培养3～7 d或更长。

2)化学法：按每升容积加入碳酸氢钠0.4 g和浓盐酸0.35 mL的比例,分别置于容器内。将容器连同接种好的培养基都放人干燥器内,盖紧干燥器的盖子,倾斜容器使浓盐酸与碳酸氢钠接触生成CO2。

3)二氧化碳培养箱：是一台特制的培养箱,既能调节CO2的含量,又能调节所需的温度。CO2从钢瓶通过培养箱,运送管进入培养箱内,调节好所需CO2,浓度自动控制器后,将接种好的培养基直接放入培养箱中培养即可。此法适于大型实验室应用。

二氧化碳培养箱广泛应用于医学、免疫学、遗传学、微生物、农业科学、药物学的研究和生产,已经成为上述领域实验室最普遍使用的常规仪器之一,其通过在培养箱箱体内模拟形成一个类似细胞/组织在生物体内的生长环境如恒定的酸碱度(pH值：7.2～7.4)、稳定的温度(37℃)、较高的相对湿度(95%)、稳定的CO2水平(5%),来对细胞/组织进行体外培养的一种装置。

用户对二氧化碳培养箱都有两条最基本的要求：一是要求二氧化碳培养箱能够对温度、二氧化碳浓度和湿度提供最精确稳定的控制,以便于其研究工作的进展;二是要求二氧化碳培养箱能够对培养箱内的微生物污染进行有效的防范,并且能够定期消除污染,以保护研究成果,防止样品损失。

二氧化碳培养箱主要包含以下几个方面功能：温度控制系统、二氧化碳浓度控制系统、湿度控制系统、防污染设计和灭菌系统。这四大基本功能决定了二氧化碳培养箱性能优越。

(3)厌氧培养法

也称“厌气培养”。这类微生物在培养时,不需要氧气参加。在厌氧微生物的培养过程中,最重要的一点就是要除去培养基中的氧气。厌氧菌需有较低的氧化—还原势能才能生长(例如破伤风梭状芽孢杆菌需氧化—还原电势降低至0.11 V时才开始生长),在有氧的环境下,培养基的氧化—还原电势较高,不适于厌氧菌的生长。为使培养基降低电势,降低培养环境的氧压是十分必要的。现有的厌氧培养法甚多,主要有生物学,化学和物理学3种方法,可根据各实验室的具体情况而选用。(www.xing528.com)

1)生物学方法

培养基中含有植物组织(如马铃薯、燕麦、发芽谷物等)或动物组织(新鲜无菌的小片组织或加热杀菌的肌肉、心、脑等),由于组织的呼吸作用或组织中的可氧化物质氧化而消耗氧气(如肌肉或脑组织中不饱和脂肪酸的氧化能消耗氧气,碎肉培养基的应用,就是根据这个原理),组织中所含的还原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化—还原电势下降。

另外,将厌氧菌与需氧菌共同培养在一个平皿内,利用需氧菌的生长将氧消耗后,使厌氧菌能生长。其方法是将培养皿的一半接种吸收氧气能力强的需氧菌(如枯草杆菌),另一半接种厌氧菌,接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上,并用石蜡密封,置37℃恒温箱中培养2～3 d后,即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。

2)化学方法

利用还原作用强的化学物质,将环境或培养基内的氧气吸收,或用还原氧化型物质,降低氧化-还原电势。

①李伏夫(B.M.JIbbob)法

此法系用连二亚硫酸钠(Sodium hydrosulphite)和碳酸钠以吸收空气中的氧气,其反应式如下：

取一有盖的玻璃罐,罐底垫一薄层棉花,将接种好的平皿重叠正放于罐内(如系液体培养基,则直立于罐内),最上端保留可容纳1～2个平皿的空间(视玻罐的体积而定),按玻罐的体积每1000 cm3空间用连二亚硫酸钠及碳酸钠各30 g,在纸上混匀后,盛于上面的空平皿中,加水少许使混合物潮湿,但不可过湿,以免罐内水分过多。若用无盖玻罐,则可将平皿重叠正放在浅底容器上,以无盖玻罐罩于皿上,罐口周围用胶泥或水银封闭。

②焦性没食子酸法

焦性没食子酸在碱性溶液中能吸收大量氧气,同时由淡棕变为深棕色的焦性没食橙(Purpurgallin)。每l00 cm3空间用焦性没食子酸1 g及10%氢氧化纳或氢氧化钾l0 mL,其具体方法主要有下列几种：

A.单个培养皿法：将厌氧菌接种于血琼脂平板。取方形玻璃板一块,中央置纱布或棉花或重叠滤纸一片,在其上放焦性没食子酸0.2 g及10%NaOH溶液0.5 mL。迅速拿去皿盖,将培养皿倒置于其上,周围以融化石蜡或胶泥密封。将此玻璃板连同培养皿放人37℃温箱培养24～48 h后,取出观察。

B.Buchner氏试管法：取一大试管,在管底放焦性没食子酸0.5 g及玻璃珠数个或放一螺旋状铅丝。将已接种的培养管放入大试管中,迅速加入20%NaOH溶液0.5 mL,立即将管口用橡皮塞塞紧,必要时周围封以石蜡,37℃培养24～48 h后观察。

C.玻罐或干燥器法：置适量焦性没食子酸于一干燥器或玻罐的隔板下面,将培养皿或试管置于隔板上,并在玻罐内置美蓝指示剂一管,从罐侧加入氢氧化钠溶液放于罐底,将焦性没食子酸用纸或纱布包好,用线系住,暂勿与氢氧化钠接触,待一切准备好后将线放下,使焦性没食子酸落入氢氧化钠溶液中,立即将盖盖好;封紧,置温箱中培养。

D.瑞(Wright)氏法：将已接种细菌的培养管的脱脂棉塞在火焰中烧灼灭菌后,塞入管中离培养基1～1.5 cm处,置适量焦性没食子酸于其上,加入10%NaOH溶液2 mL,迅速用橡皮塞将管口塞紧,以胶泥或石蜡严密封闭置温箱中培养。

E.史(Spray)氏法：厌氧培养皿,在皿底一边置焦性没食子酸,另一边置氢氧化钠溶液,将已接种的平皿翻盖于皿上,并将接合处用胶泥或石蜡密封完全,然后摇动底部,使氢氧化钠溶液与焦性没食子酸混合,置温箱中培养。

F.平皿法：置一片中有小圆孔的金属板于两平皿之间,上面的平皿接种细菌,下面的平皿盛焦性没食子酸及氢氧化钠溶液,用胶泥封固后,置温箱中培养。

G.硫乙醇酸钠法：硫乙醇酸钠(CH2(SH)COONa)是一种还原剂,加入培养基中,能除去其中的氧或还原性物质,促使厌氧菌生长。其他可用的还原剂包括葡萄糖、维生素C、半胱氨酸等。

液体培养基法：　将细菌种入含0.1%的硫乙醇酸钠液体培养基中,37℃培养24～48 h后观察,本培养基中加美蓝液作为氧化还原的指示剂,在无氧条件下,美蓝被还原成无色。

固体培养基法：常采用特殊构造的Brewer培养皿,可使厌氧菌在培养基表面生长而形成孤立的菌落;操作过程是先将Brewer氏皿干热灭菌,将溶化且冷却至50℃左右的硫乙醇酸钠固体培养基倾入皿内。待琼脂冷凝后,将厌氧菌接种于培养基的中央部分。盖上皿盖,使皿盖内缘与培养基外围部分相互紧密接触。此时皿盖与培养基中央部分留在空隙间的少量氧气可被培养基中的硫乙醇酸钠还原,故美蓝应逐渐褪色,而外缘部分,因与大气相通,故仍呈蓝色。将Brewer氏培养皿置于37℃恒温箱内,经过24～48 h后观察。

3)物理学方法

利用加热、密封、抽气等物理学方法,以驱除或隔绝环境及培养基中的氧气,使其形成厌氧状态,有利于厌氧菌的生长发育。

①厌氧罐法

常用的厌氧罐有Brewer氏罐,Broen氏罐和Mclntosh-Fildes二氏罐。将接种好的厌氧菌培养皿依次放于厌氧罐中,先抽去部分空气,代以氢气至大气压。通电,使罐中残存的氧与氢经铂或钯的催化而化合成水,使罐内氧气全部消失。将整个厌氧罐放人孵育箱培养。本法适用大量的厌氧菌培养。

②真空干燥器法

将欲培养的平皿或试管放入真空干燥器中,开动抽气机,抽至高度真空后,替代以氢、氮或二氧化碳气体。将整个干燥器放进孵育箱培养。

③高层琼脂法

加热融化高层琼脂,冷至45℃左右接种厌氧菌,迅速混合均匀。冷凝后37℃培养,厌氧菌在近管底处生长。

④加热密封法

将液体培养基放在阿诺氏蒸锅内加热l0 min,驱除溶解于液体中的空气,取出,迅速置于冷水中冷却。接种厌氧菌后,在培养基液面覆盖一层约0.5 cm的无菌凡士林石蜡,置37℃培养。此外,尚有摇振培养法。

⑤二氧化碳培养法

少数细菌如布氏杆菌(牛型)等,孵育时,需大气中添加5%～10%二氧化碳,方能使之生长繁殖旺盛。常用的方法是置于CO2培养箱中进行培养;最简单的二氧化碳培养法是在盛放培养物的有盖玻璃缸内,燃点蜡烛,当火焰熄灭时,该缸的大气中,就约增加了5%～10%的二氧化碳。也可用化学物质作用后生成二氧化碳,如碳酸氢钠与硫酸钠或碳酸氢钠与硫酸作用即可生成二氧化碳。若各用0.4% NaHCO3与30% H2SO4 l mL,则可产生22.4 mL的二氧化碳气体。