免疫磁珠技术在病原微生物检测中的应用

(一)免疫磁珠分离技术

免疫磁珠分离技术(Immunomagnetic Separation,IMS)整合了免疫反应的高度特异性和磁性分离的快速、简单优点,广泛用于细胞的分离提纯、体外扩增、HLA分型、靶向释药、微生物检测等。

1.原理

免疫磁珠分离技术借助免疫磁珠捕获样品中靶物质,通过磁珠在磁场中的运动使靶物质(如病原微生物)分离。免疫磁珠由磁性载体和免疫培养基结合而成。天然磁性材料可从磁性细菌中分离获得,该技术生产的磁珠仅在磁场中表现出磁性,因此向样品中加入磁珠时,磁珠分散并能与样品充分混合;当在试管一侧添加强磁场时,磁珠能迅速发生力学迁移并吸附在靠近磁场的试管内壁,移除样品后即可将磁珠分离。免疫配基包被于磁珠外表面,主要包括一抗、二抗和蛋白质A/G。包被一抗的免疫磁珠可直接使用,方便快捷,但仅适用于特定靶物质的分离;包被二抗或蛋白质A/G的磁珠必须再包被一抗才能捕获相应靶物质,但其能与多种相应的一抗结合,灵活性强。

免疫磁珠表面的特异抗体能与样品中的靶物质(具有相应的表面抗原)发生免疫反应,形成免疫磁珠-靶物质复合物。在外加磁场中,免疫磁珠-靶物质复合物被吸附并滞留在磁场中,而无相应表面抗原的物质由于不能与免疫磁珠表面的特异抗体结合,没有磁性,不能在磁场中停留,从而可分离靶物质。免疫磁珠分离技术用于病原微生物检测时,抗体特异性、磁珠尺寸及品质、孵育时间、pH值均可影响其分离纯化效果。

2.应用

免疫磁珠分离技术对病原菌的检测逐步标准化。免疫磁珠分离技术早在21世纪初就已经被标准化应用,目前食品安全国家标准《食品微生物学检验 大肠埃希氏菌O157：H7/NM检验GB 4789.36-2016》仍将免疫磁珠分离技术作为分离纯化目标检测菌的手段。

目前,已有商品化的试剂盒用于多种病原菌的免疫磁珠检测,如沙门氏菌、李斯特菌、军团菌、E.coliO157,这使常见病原菌的检测更加方便、规范。

(二)免疫磁珠仪标准操作程序

1.产品厂家型号

厂家：美国ABI,型号：Pathatrix全自动微生物富集纯化系统。

2.产品特点

2.1　包被有致病菌抗体的磁珠,可在复杂的样品基质中与目标致病菌相结合,并将致病菌浓缩出来。磁珠可将极微量的致病菌从样品中浓缩、纯化出来,提高了致病菌的检出率,节省了检测时间;

2.2　浓缩出的致病菌,可与各种下游检测技术完全兼容,包括选择性培养基、ELISA、胶体金检测、PCR或者荧光定量PCR反应;

2.3　可处理的样品量大,最多可达60 mL,可以处理微生物的增菌液,短时间增菌后,将增菌液进行纯化浓缩,可以有效减少检测时间;

2.4　浓缩过程完全自动化,速度快,仅需15 min即可浓缩出致病菌;

2.5　支持混样操作,最多支持10个样品混合,进一步提高了筛选工作的效率。

3.工作原理

Pathatrix系统利用独有的抗体包被技术,整个液体样品在封闭的系统内多次反复循环,在固定有包被抗体磁珠的“捕获相”,致病菌与磁珠相结合,经过多次清洗和纯化,被捕获的致病菌被浓缩和纯化出来,实现一次性对多达10～60 mL样品中目标细菌或病毒的捕获和纯化,以便用于下游的检测中,包括选择性平板、ELISA、胶体金、PCR或者荧光定量PCR反应。

4.主要参数

4.1　支持样品混合的操作流程,可以一次混合5～10个样品。

4.2　每轮反应15 min完成,每轮可同时进行5组实验,最大处理能力为200样品/小时(按每次10个样品做一个混样计算)。

4.3　配套可选的试剂盒包括：沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌O157、弯曲菌、克罗诺杆菌、各种病毒。此外,生产商还可以根据客户需求,提供磁珠订制服务。支持其他的商品化免疫磁珠富集试剂盒,从而实现如金黄色葡萄球菌,STEC,军团菌、贾第鞭毛虫和隐孢子虫等的免疫富集。

5.操作程序

5.1　准备工作：根据相应检测标准的要求进行称样、均质、增菌培养(图2-34,A)。

5.2　将样品容器和洗脱容器都放到管架上,将增菌后的样品(最多65 mL)加入样品容器中(左),并将35 mL PBS洗脱液倒进洗脱容器内(右),并盖好盖子(图2-34,B)。(www.xing528.com)

5.3　在样品容器盖嘴中添加50μl的珠剂量(图2-34,C)。

图2-34

5.4　从袋子中取出无菌的捕获器组件,并使活塞销向左,将阀盖嘴对接并推到底(图2-35,D)。

5.5　小心地将上面的容器及组件从管架上取下,避免泄漏。将卡座从主机中取出放到卡座架上,并将容器及组件嵌入(图2-35,E)。

5.6　将磁铁组件放置到锁定位置,检查卡座侧面按钮能否正常释放,然后再将磁铁组件放置锁定位置(图2-35,F)。

图2-35

5.7　将卡座插入pathatrix®系统,锁定到位(图2-36,G)。

5.8　按卡座上方的编号按钮开始运行(图2-36,H)。

5.9　运行完成后,LED灯将闪烁绿色和红色,按编号按钮启动排水步骤(图2-36,I)。

图2-36

5.10　当排水步骤完成后,LED灯将变成红色,将卡座取出仪器(图2-37,J)。

5.11　将卡座放置在卡座架上,并从注射器开始从上往下拆下消耗品和容器,防止溢出(图2-37,K)。

5.12　将容器放入管架,然后从洗脱容器上拆下盖子,仅留下洗脱容器,丢弃其他全部的消耗品和样品容器(图2-37,L)。

图2-37

5.13　将洗脱容器放在管架上1min,以便收集磁珠(图2-38,M)。

5.14　不将洗脱容器从管架取下,用移液枪清除洗脱容器中残留的清洗缓冲液,仅留下磁珠(图2-38,N)。

5.15　往洗脱容器中加入100μL PBS,混匀磁珠,然后各取50μL免疫磁珠悬液分别转移至目标菌的选择性平板,一半涂布一半划线接种。待琼脂表面水分完全吸收后,翻转平板,于要求的温度时间培养(图2-384,O)。

图2-38

6.设备图片

图2-39　Pathatrix全自动微生物富集纯化系统