生物安全柜：工作原理与运行指标检查方法

(一)生物安全柜概述

生物安全柜是一种负压过滤排风柜,它是在生物安全实验室里操作危害性生物样本过程中,防止气溶胶散逸的安全设备。利用负压过滤技术,将操作感染性样本时产生的气溶胶屏蔽在一个局限的空间里,从而保护操作人员、样本和环境。因此生物安全柜是生物安全试验中不可缺少的设备,是生物安全二级及以上级别生物安全实验室中操作感染性材料的中心平台。

1.生物安全柜的工作原理及结构

生物安全柜是利用高效空气过滤器对通过的空气中的微笑粒子具有捕集能力的特性,再结合生物安全柜内负压的环境和精巧设计的气体流动模式,从而实现对危害性生物气溶胶的屏蔽。

高效空气过滤器是生物安全柜的关键部件,它是由玻璃纤维制成的滤网,在气流阻力为245 Pa时,对粒径≥0.3μm的粒子的捕集效率可达到99%,绝大多数以气溶胶途径感染的生物危害因子都在其滤除范围内。

不同类型的生物安全柜运行模式基本相同,即风机转动,从柜内向柜外排气,柜内形成负压,新鲜空气从操作口吸入,在操作口处形成气幕,气幕可以和柜内的负压可以防止气溶胶外泄,从而保护操作者;柜内循环的空气经送风过滤器过滤后排出柜外,从而保护环境。

2.生物安全柜的分级

按照对操作者、环境和受试样本的保护程度的侧重不同,生物安全柜的气流及隔离屏障设计结构也不同,生物安全柜分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级。

(1)Ⅰ级生物安全柜

1)Ⅰ级生物安全柜用于处理那些对操作者几乎不会造成危害的样本,它由工作区、前视窗、排风通道、排风高效过滤器和风机构成。Ⅰ级生物安全柜工作时,新鲜空气从操作口吸入,吸入的气流将工作区产生的污染空气阻挡在柜内,污染空气只能通过高效过滤器排出并被净化。

2)由于进入Ⅰ级生物安全柜的新鲜空气直接吹向样本,因此,Ⅰ级生物安全柜不能对受试样本提供保护,需要无菌操作的样本不能在一级生物安全柜内进行处理。

3)生物安全柜与超净工作台和通风橱的区别　超净工作台和通风橱是各级疾控机构普通装备的设备,Ⅰ级生物安全柜与超净工作台和通风橱三种设备的构造非常接近,但是用途却截然不同。

(2)Ⅱ级生物安全柜

1)Ⅱ级生物安全柜的型别：为满足使用Ⅱ级生物安全柜处理不同危害等级病原微生物的需求,依据其对操作者保护程度的不同,兼顾制造成本,Ⅱ级生物安全柜从设计上分为A1、A2、B1和B2四种型别。

2)构造和气流模式

除B2型生物安全柜之外,A1、A2和B1型Ⅱ级生物安全柜的构造基本相同,下面以使用最为普遍的A2型生物安全柜为例,介绍Ⅱ级生物安全柜的构造和气流模式。A2型生物安全柜由上部柜体和支架两部分组成：

上部柜体主要有以下部件和系统：

工作区：包括工作台面、视窗玻璃和操作口。

风机：使空气在生物安全柜内始终以需要的流速和流量流动。

送风过滤器：为工作区提供洁净的气流。

散流装置;将送风过滤器送出的气流分散成均匀地垂直层流。

排风过滤器：滤除外排空气中的感染性微粒。

回风通道：以负压的方式输送柜内的空气。

控制和指示系统：由控制面板和显示屏组成,通过控制面板可以对风机、前窗玻璃、照明灯和紫外灯等进行控制;显示屏通道显示风压状态、层流风速、进气流速、工作区温度等信息。

监测及告警系统：监测系统由风速、风压、气流模式等传感器组成,它实时地向控制系统提供风机运转所需参数,保证柜内的气流平衡,当柜内的气流平衡受到破坏时,以声、光告警的方式提醒操作者,此时的生物安全柜已处于不安全状态,继续使用会危及使用者安全。

A2型生物安全柜的气流模式：

A2型生物安全柜工作台面的前沿设计有进气格栅,后沿有垂直层流回风格栅。当生物安全柜正常运转时后,安全柜从操作口吸入新鲜空气、吸入的新鲜空气全部进入前沿的进气隔栅,同时垂直层流的一半也从前沿进气隔栅进入,此时在前沿隔栅的上方,吸入空气的流速比垂直层流的流速高,因此形成了一道稳定的气幕,将污染空气隔绝在柜内;垂直层流经过样本后成为污染空气,但很快被吸入工作台面上的前后沿隔栅孔进入回风通道,因此,污染空气在工作区停留的时间很短,外泄的机会减少,有利于保护操作者;吸入的新鲜空气与全部的污染空气在工作台面下混合后经回风通道送至生物安全柜顶部,其中30%的经外排过滤器过滤后排除柜外,70%的空气经送风过滤器过滤后形成洁净的垂直层流吹向工作区。这一循环过程达到平衡稳定后,生物安全柜就同时实现了对操作者,样本和环境的保护。

(3)Ⅲ级生物安全柜

Ⅲ级生物安全柜是为生物安全防护等级为4级实验室而设计的,柜体完全气密,工作人员通过连接在柜体的手套进行操作,俗称手套箱(Golve box),试验品通过双门的传递箱 进出安全柜以确保不受污染,适用于高风险的生物试验,如进行SARS、埃博拉病毒相关实验等。

3.生物安全柜的安装要求

Ⅱ级A2型生物安全柜安装为例介绍生物安全柜的安装要求：

(1)安装和维修生物安全柜都必须要有资质的专业技术人员进行。

(2)安装生物安全柜的房间必须是洁净的,含尘量高的空气会缩短高效过滤器的使用寿命。

(3)供生物安全柜使用的电源必须是可靠和稳定的,其路线上不得与其他大功率电器共用一个熔断器或空气保护开关,要最大限度地避免线路故障而导致的安全意外。

(4)生物安全柜应当安装在室内空气最为稳定的部位,要避免靠近门,窗或者将操作口对准门窗安装,更不能将生物安全柜安装在人员必经的通道处。

(5)在有定向气流的房间里,生物安全柜应当装在房间的出风口附近。

(6)生物安全柜的两侧和后部最好分别留有20～40 cm的间距,以方便监测和维护。

(7)Ⅱ级A2型生物安全柜的外排空气通常情况下直接排向室内,不需要外接排风管,在确需外接排风管时,外接排风管上必须设置止回装置,因为室外的强劲气流可能通过外接排风管倒灌,破坏安全柜内的气流平衡,造成安全隐患。

4.生物安全柜的使用

(1)实验前计划并准备好本次试验所需使用的器材,将器材一次性地放入生物安全柜内,应最大限度地避免在实验过程中向生物安全柜内放入器材,同时注意框内不宜放入过多物品。

(2)开启生物安全柜,检查工作区风速、进气流量和过滤器风压等各项运行指标是否正常,如出现异常,查明故障原因。

(3)调整好操作者座位的高度,保证其面部在工作窗口之上,将视窗玻璃调节到正常高度后,运转生物安全柜5～10 min,净化工作区。

(4)开始操作之前操作者应将双手放入安全柜内至少静止1 min,待操作口气幕稳定后再开始操作。

(5)尽量在操作台面的后部区域进行样本操作。

(6)为防止样本溅落污染工作台面,可在工作台面上平铺一块大小适当,浸有消毒剂的毛巾或专用台垫。

(7)生物安全柜内的实验器材要按照洁净物品和污染物品区分摆放,盛放污染物的容器里,因盛有适量的消毒剂并盛放在工作台面的后部,实验过程中污染的器物必须经过消毒包装等有效处理后才能拿出安全柜。

(8)实验结束后,移出所有的实验器材,用消毒剂擦拭工作台面,继续运转约十分钟,使柜内的污染空气得到净化。

(9)关闭风机,开紫外线灯照约30 min。

(10)关闭电源开关。

(11)填写使用记录,完整的使用记录是判定生物安全性能和高效空气过滤器使用寿命的重要依据。

5.生物安全柜操作要点

(1)缓慢移动原则：为了避免影响正常的风路状态,柜内操作时手应该尽量平缓移动。

(2)物品平行摆放原则：为了避免物品和物品之间的交叉污染现象产生,在柜内摆放的物品应该尽量呈横向一字摆开,避免回风过程中造成交叉污染。同时避免堵塞背部回风隔栅影响正常风路。

(3)避免震动原则：柜内尽量避免震动仪器(例如离心机、旋涡振荡器等)的使用,因为震动会使得积留在滤膜上的颗粒物质抖落,导致操作室内部洁净度降低,同时如果在前操作面平衡失败还会引起安全柜对操作者的污染。

(4)不同样品柜内移动原则：柜内两种及以上物品需要移动时,一定遵循低污染性物品向高污染性物品移动原则,避免污染性高的物品在移动过程中产生对柜体内部的大面积污染。

(5)明火使用原则：柜内尽量不要使用明火。因为在明火使用过程中产生的细小颗粒杂质将被带入滤膜区域,这些高温杂质会损伤滤膜。无法避免一定需要使用的时候,宜使用低火苗的本生灯。

6.生物安全柜的维护和消毒

(1)生物安全柜的维护

在生物安全柜安装和移动之后,或每次维修后,或每隔一定的时间,以及其他有必要的时候,应该有资质的专业人员按照生产商的说明,对安全柜的运行性能进行验证以检查其是否符合国家及国际的相关性能标准。

(2)生物安全柜的消毒

1)表面消毒：每次使用安全柜后都必须对工作区表面进行消毒,用合适的消毒剂擦拭工作区表面后,紫外灯照射30 min。

2)熏蒸消毒：当需要移动生物安全柜或者对其进行内部维修时,必须用熏蒸的方法对安全柜内部进行消毒,通常采用甲醛熏蒸,方法如下：

①在台面上放置一个可以外部控制的电加热器。

②计算安全柜的内部容积,按60 ml/m3的比例取36%的福尔马林到一个烧杯;按60 mL/m3的比例量取水到另一个烧杯。福尔马林用于产生甲醛气体,水蒸发后增加安全柜内的湿度,当相对湿度在65%以上,温度在24℃～40℃时,甲醛气体消毒的效果最好。也可以用10 g/m3比例的多聚甲醛代替福尔马林。(www.xing528.com)

③将两个烧杯放在电加热器上,密封安全柜排风口和前操作口。

④打开电热器电源,加热使福尔马林和水蒸发,当福尔马林蒸发到一半时,开启安全柜风机10～15 s,到福尔马林蒸发完,再开启安全柜风机10～15 s。

⑤切断电加热器电源,熏闷安全柜2～6 h。

⑥打开安全柜排风口,开启安全柜风机,最后打开前操作口,排出柜内的甲醛气体。甲醛气体对人体有害,操作者应该佩戴适合甲醛的吸收保护装置,并保证室内空气能够顺畅外排。

⑦熏蒸后的安全柜必须空运行2～4 h后才能使用。

7.生物安全柜在微生物实验室应用

生物安全柜是微生物实验室重要的安全设备,形成最主要的防护屏障,可以防止有害悬浮微粒的扩散,对实验者、实验物和环境提供保护,安全应用于对高危险微生物、有毒物质和放射寡核苷酸的操作。所有可能使致病微生物及其毒素溅出或产生气溶胶的操作,都必须在生物安全柜内进行。

根据生物安全柜的强制性行业标准《中华人民共和国医药行业标准YY 0569-2011 II级生物安全柜》规定,只有获得国家食品药品监督管理局颁发的三类医疗器械注册证的产品才能真正保护操作人员、实验室环境和操作样本。生物安全柜提供对人、样品和环境的三重保护。生物安全柜具备气流控制及高效空气过滤装置的操作柜,可有效降低实验过程中产生的有害气溶胶对操作者和环境的危害。国家发布了国务院424号令《病原微生物实验室管理条例》和国家标准《实验室 生物安全通用要求》GB 19489-2008,强调了生物安全柜作为一种生物实验室的主要安全设备,对保护实验室工作人员是必不可少的,要求生物实验室操作人员必须具备规范化、标准化地使用生物安全柜的能力。

目前常用的生物安全柜进口品牌有：新加坡ESCO、美国/Thermo Scientific、意大利Euroclone、西班牙TELSTAR、荷兰TELSTAR、美国BioX等,国产品牌有：上海/博迅、青岛/海尔、上海/智城、香港HealForce等。

(二)生物安全柜操作程序

1.产品厂家及型号

厂家：新加坡ESCO,型号：AC2-S生物安全柜。

2.产品特点用途

Esco独有的DynamicTM负压防泄露设计,负压腔环绕整个可能受污染的正压区域,防止因滤器破损、密封失效等原因造成的泄露标配两块长效型微皱褶无间隔ULPA级超高效过滤器,针对>0.12μm颗粒具有99.999%的截留效率倾斜式过滤器符合柜体工程学设计,5度倾斜式人体工程学设计,长时间操作不易疲劳,保证操作室内层降气流的均匀分布Esco最新型SentinelTM超大屏数显微电脑程控系统、无边框、双层覆膜、防紫外线、防爆钢化玻璃前窗>6 mm,易于清洁,使用更安全一体式工作台面便于拆卸,由整块304不锈钢板一次冲压成型,方便移动和清洁紫外灯安装在前部控制器后面,处于操作人员视线之外,避免眼睛直视Esco专利IsocideTM抗菌涂层,避免柜体表面细菌、微生物滋生污染增强的侧壁引流孔设计,将有效防止逆流、湍流形成的可能超大工作空间,Esco的0.9 m生物安全柜相当于传统1.2 m柜体的操作空间。

应用于微生物和动物细胞培养、食品安全、临床和医院、洁净室、半导体、生物制药、医疗设备制造等,用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料。

3.主要参数

3.1　获得中国医疗器械注册证和欧盟EN12469认证,工作区内空气洁净度标准符合ISO14644.1　Class 3。

3.2　独有的DynamicTM负压防泄漏设计,负压腔环绕整个可能受污染的正压区域,防止因滤器破损、密封失效等原因造成的泄漏。

3.3　标配两块长效型微皱褶无间隔ULPA超级高效过滤器,针对>0.12　μm颗粒具有99.99　9%的截流效率。

3.4　5度倾斜式人体工程学设计,长时间操作不易疲劳。

3.5　紫外灯安装在前部控制器后面,处于操作人员视线之外,避免眼睛直视。

3.6　无边框、双层覆膜、防紫外线、防暴钢化玻璃前窗>6mm,易于清洁。

3.7　专利IsocideTM抗菌涂层,避免柜体表面细菌、微生物滋生污染。

3.8　前窗通过位置感应器确定前窗高度,并且与紫外灯联锁。

3.9　操作台面是一体成型不锈钢平面式设计,没有任何焊接或螺丝,不会形成污染物累积,可以提起并取出,方便清洁及消毒。

3.10　最新型SentinelTM超大屏数显微电脑程控系统,各项气流数值可在液晶控制屏上实时显示。

3.11　增强的侧壁引流孔设计,将有效防止逆流、湍流形成的可能。

3.12　超大工作空间,Esco的0.9　m生物安全柜相当于传统1.2　m柜体的操作空间。

3.13　德国EBM免维护风机系统,结构紧凑、噪音低,能够在电压变化或过滤器堵塞造成压降后,自动调整风机工作电压,提供平稳安全气流。

3.14　噪音(依据EN12469标准)<59 dBA。

3.15　30%气体外排,70%气体循环;操作区尺寸：1270 x 560 x 670mm。

3.16　进气气流流速≥0.5　m/s,沉降气流流速≥0.3　m/s。

4.操作规程

4.1　操作前应将本次操作所需的全部物品移入安全柜,避免双臂频繁穿过气幕破坏气流;并且在入前用75%酒精擦拭表面消毒,以去除污染。

4.2　打开风机5～10 min,待柜内空气净化并气流稳定后再进行实验操作。将双臂缓缓伸入安全柜内,至少静止1 min,使柜内气流稳定后再进行操作。

4.3　安全柜内不放与本次实验无关的物品。柜内物品摆放应做到清洁区、半污染区与污染区基本分开,操作过程中物品取用方便,且三区之间无交叉。物品应尽量靠后放置,但不得挡住气道口,以免干扰气流正常流动。

4.4　操作时应按照从清洁区到污染区进行,以避免交叉污染。为防可能溅出的液滴,可在台面上铺一用消毒剂浸泡过的毛巾或纱布,但不能覆盖住安全柜格栅。

4.5　柜内操作期间,严禁使用酒精灯等明火,以避免产生的热量产生气流,干扰柜内气流稳定;且明火可能损坏HEPA滤器。

4.6　工作时尽量减少背后人员走动以及快速开关房门,以防止安全柜内气流不稳定。

4.7　在实验操作时,不可打开玻璃视窗,应保证操作者脸部在工作窗口之上。在柜内操作时动作应轻柔、舒缓,防止影响柜内气流。

4.8　安全柜应定期进行检测与保养,以保证其正常工作。工作中一旦发现安全柜工作异常,应立即停止工作,采取相应处理措施,并通知相关人员。

4.9　工作完全后,关闭玻璃窗,保持风机继续运转10～15 min,同时打开紫外灯,照射30 min。

4.10　安全柜应定期进行清洁消毒,柜内台面污染物可在工作完成且紫外灯消毒后用2%的84消毒液擦拭。柜体外表面则应每天用1%的84消毒液擦拭。

4.11　柜内使用的物品应在消毒后再取出,以防止将病原微生物带出而污染环境。

5.设备的维护及保养

5.1　每次实验结束后应对工作室进行清洗和消毒。

5.2　预过滤器一旦受损,应及时更换。

5.3　HEPA过滤器的使用寿命到期后,应立即更换。由于过滤器可能带有污染物,操作时应注意安全防护,最好请经过专门训练的专业人员来更换。

5.4　有下列情况之一时,应对生物安全柜进行现场检测：

5.4.1　生物安全实验室竣工后,投入使用前,生物安全柜已安装完毕。

5.4.2　生物安全柜被移动位置。

5.4.3　对生物安全柜进行检修。

5.4.4　生物安全柜更换HEPA过滤器后。

5.4.5　生物安全柜一年一度的常规检测。

6.使用中的注意事项及常见故障的排除

6.1　缓慢移动原则：为了避免影响正常的风路状态,柜内操作时手应该尽量平缓移动。

6.2　物品平行摆放原则：为了避免物品和物品之间的交叉污染现象产生,在柜内摆放的物品应该尽量呈横向一字摆开,避免回风过程中造成交叉污染。同时避免堵塞背部回风隔栅影响正常风路。

6.3　避免震动原则：柜内尽量避免震动仪器(例如离心机、旋涡振荡器等)的使用,因为震动会使得积留在滤膜上的颗粒物质抖落,导致操作室内部洁净度降低,同时如果在前操作面平衡失败还会引起安全柜对操作者的污染。

6.4　不同样品柜内移动原则：柜内两种及以上物品需要移动时,一定遵循低污染性物品向高污染性物品移动原则,避免污染性高的物品在移动过程中产生对柜体内部的大面积污染。

6.5　明火使用原则：柜内尽量不要使用明火。因为在明火使用过程中产生的细小颗粒杂质将被带入滤膜区域,这些高温杂质会损伤滤膜。无法避免一定需要使用的时候,宜使用低火苗的本生灯。

7.设备图片

图2-22　ESCO AC2-S生物安全柜