食品微生物检验的常用培养基及配制要求

人工制备培养基的目的在于给微生物创造一个良好的营养条件,培养基是按照微生物生长繁殖或积累代谢产物所需要的各种营养物质,用不同组分的营养物质由人工配制而成的营养基质,专供微生物培养、分离鉴别、研究和保存用,培养基除营养成分外,还要求一定的酸碱度,一般pH在7.2～7.4之间。

(一)培养基的分类

1.按培养基成分分类

(1)天然培养基

是一类利用动、植物或微生物体包括用其提取物制成的培养基,这是一类营养成分既复杂又丰富、难以说出其确切化学组成的培养基。此类培养基比较经济,除实验室经常使用外,更适宜于在生产上用来大规模地培养微生物和生产微生物产品。

(2)合成(组合)培养基是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制成的培养基。该类培养基的组成成分精确、清楚,重复性强,但微生物生长较慢,且价格昂贵,一般适用于实验室进行有关微生物营养需要、代谢、分类鉴定、生物测定以及菌种选育、遗传分析等方面的研究工作。如高氏培养基、察氏培养基等。

(3)半组合培养基

指一类主要由化学试剂配制,同时还添加某些天然成分的培养基,以更有效地满足微生物对营养物的需要,如马铃薯蔗糖培养基。

2.按培养基的物理状态分类

(1)液体培养基

不加凝固剂(常用凝固剂为琼脂)的液体状态培养基。是一类呈液体状态的培养基,在实验室和生产实践中用途广泛,尤其适用于大规模地培养微生物。液体培养基不含任何凝固剂,菌体与培养基充分接触,操作方便。可据培养后的浊度判断微生物的生长程度。

(2)固体培养基

在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固体状态的培养基或农副产品培养基。固体培养基即天然固体营养基质制成的培养基,或液体培养基中加入一定量凝固剂(琼脂1.5～2%)而呈固体状态的培养基。为微生物的生长提供营养表面。常用于微生物的分离、纯化、计数等方面的研究。

(3)半固体培养基

在液体培养基中加入0.2%～0.5%凝固剂而成的半固体状培养基。

3.按照培养基的用途分类

(1)基础培养基

含有细菌生长所需的基本的营养成分,提供基本的碳源、氮源及生长素,最常用的基础培养基是肉浸液,主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。基础培养基广泛用于细菌的检验,也是配置其他培养基的基础成分。

(2)营养培养基或加富培养基

加富培养基是指在普通培养基里加过血、血清、动物(或植物)组织液或其他营养物质(或生长因子)的一类营养丰富的培养基,用以培养某种或某类营养要求苛刻的异养微生物或用以富集(数量上占优势)和分离某种微生物,最常用的营养培养基如血平板。

(3)选择培养基

选择培养基是根据某种或某一类群微生物的特殊营养需要或对某种化合物的敏感性不同而设计出来的一类培养基。利用这种培养基可以将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。是一类根据某微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基。利用这种培养基可用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来,广泛应用于菌种的筛选等领域。

抑制性选择培养基：在筛选的培养基中加入某种制菌物质,经培养后,使原有试样中对此抑制剂表现敏感的优势菌的生长大受抑制,而原先处于劣势的分离对象却趁机大量增殖,最终在数量上占了优势。

(4)鉴别培养基

普通培养基中加入能与某种代谢产物发生反应的指示剂或化学药品,从而产生某种明显的特征性变化,以区别不同的微生物。用于鉴别不同类型微生物的培养基,在普通培养基中加入能与某种代谢产物发生反应的指示剂或化学药品,从而产生某种明显的特征性变化,以区别不同的微生物。

(5)特殊培养基

包括厌氧培养基、细菌L型培养基。厌氧培养基是为了培养专性厌氧菌的培养基,除含有合适的营养成分外,还加入还原剂以降低培养基的氧化还原电势。常用的厌氧培养基有庖肉培养基、巯基乙醇酸钠培养基等。细菌L型由于细胞内的渗透压较高而细胞壁缺损,培养细菌L型的培养基常采用高渗低琼脂培养基。

4.根据所培养的微生物的类群分类

(1)细菌培养基,专门用作细菌的培养。

(2)放线菌培养基,专门用作放线菌的培养。

(3)霉菌培养基,专门用作霉菌的培养,一般可用沙保葡萄糖琼脂,含蛋白胨、葡萄糖、琼脂,其pH为4～6,一般细菌不易生长。

5.根据培养目的分类

(1)种子培养基(www.xing528.com)

是为保证发酵生产获得大量优质种子而设计的培养基,特点是营养较丰富,氮源比例较高。有时为使菌种能迅速适应后面的发酵条件,还有意识地加入发酵培养基的基质。

(2)发酵培养基

用于生产预定发酵产物,一般以碳为主要元素,碳源含量往往高于种子培养基,大规模生产时,原料应价廉易得,还应有利于下游的分离提取的配养基。

(二)培养基的配置要求

培养基是微生物检测的基础,培养基的质量是保证微生物实验成功的关键。培养基的制备、合理的贮存、培养基的质量检验,是确保提供持续高质量的培养基关键。不同的培养基配制的程序有所不同,但一般培养基配制程序主要有7个步骤：调配、融化、矫正pH、澄清过滤、分装、灭菌及鉴定。因此在制备培养基时,应掌握如下要求,从每个配置程序进行控制和要求。

1.配制培养基用具及容器

配制培养基所用的用具及容器必须是清洁或是灭菌的,忌用铁或钢质器皿,要求没有抑制细菌生长的物质存在,防止配方中带入外来物质,改变培养基的最终成分。一些特殊不易洗刷清洁的玻璃器皿,必要时可用重铬酸钾硫酸清洁浸泡后,取出置5%氢氧化钠溶液浸泡数分钟,再用3%盐酸溶液进行中和,然后用清水冲洗,烘干后备用。

2.培养基配置原料的质量控制

培养基必须含有细菌生长繁殖所需要的营养物质,配制培养基的主要原料有蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、胆盐、无机盐和琼脂等,这些主要原料的优劣,直接影响到培养基的质量,由此也将影响检验质量。因此必须对培养基配置原料进行质量控制,一般可从感官、理化、物理、生物学等方面进行控制。

目前大多用成品的干燥培养基干粉,干燥培养基干粉含有活性物质、遇热易分解的物质,应仔细查看存放条件,多数也须放在2℃～8℃条件保存。有的培养基则以存放于10℃～15℃条件为宜,如含有高浓度胆盐的培养基。

3.称量过程的控制

使用脱水培养基和培养基组分来制备培养基时要准确称量,按培养基配方比例依次准确地称取药品,放入适当大小的烧杯中。蛋白胨极易吸水,称量时动作要快。培养基中的抑制剂及指示剂一定要精确称量,抑制剂要注意合理配伍,化学药品必须纯净;使用己校正的具有适合的称量范围的天平,电子天平称量也应该记录。

4.加热溶解

向烧杯内加入所需水量的一部分,放到电炉上加热,同时不断进行搅拌,使其溶解,最后补足所需水分。加热过程所蒸发的水分,应在全部原料溶解后补足所需水分。目前一般选择具有良好加热性能的红外加热炉完成加热溶解过程。

5.培养基pH的控制

培养基的酸碱度应符合细菌生长要求,按各种培养基要求准确测定调节pH值。干燥培养基在工厂生产时,对培养基pH进行了一定的调试,在实际工作中,由于配制的环境、配制所用的溶剂(蒸馏水)pH等条件有所不同,都会对所用的培养基pH要有所影响,因此对于干燥培养基配制,同样需要进行pH测验。调pH值用精密pH试纸(或pH电位计、氢离子浓度比色计)测试培养基的pH值,如不符合需要,可用10% HCl或10% NaOH进行调节,直到调节到配方要求的pH值为止。

6.澄清过滤、分装

过滤用滤纸、纱布或棉花趁热将已配好的培养基过滤。用纱布过滤时,最好折叠成六层,用滤纸过滤时,可将滤纸折叠成瓦棱形,铺在漏斗上过滤。没有悬浮物的不用过滤。分装时将培养基趁热加至漏斗上进行分装。如果要制作斜面培养基,须将培养基分装于试管中,装试管时,装量不要超过试管的1/4,如果要制作平板培养基或液体、半固体培养基,则须将培养基分装于三角瓶或锥形瓶内,一般以其容积的1/2为宜。注意管口不要沾上培养基。在漏斗下口处套有一段透明胶管,胶管下部用弹簧夹夹紧。分装时,一手捏松弹簧夹,使培养基流出,另一只手握住几支试管或锥形瓶,依次接取培养基。分装时,注意不要使培养基粘附管口或瓶口,以免浸湿棉塞引起杂菌污染。

7.加塞、包扎、标记

试管应先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮纸,贴上标签,注明培养基名称、日期、组别。分装完毕后,需要用棉塞堵住管口或瓶口。堵棉塞的主要目的是过滤空气,避免污染。棉塞应采用普通新鲜、干燥的棉花制作,不要用脱脂棉,以免因脱脂棉吸水使棉塞无法使用。制作棉塞时,要根据棉塞大小将棉花铺展成适当厚度,揪取手掌心大小一块,铺在左手拇指与食指圈成的圆孔中,用右手食指插入棉花中部,同时左手食指与拇指稍稍紧握,就会形成1个长棒形的棉塞。棉塞做成后,应迅速塞入管口或瓶口中,棉塞应紧贴内壁不留缝隙,以防空气中微生物沿皱折侵入。棉塞不要过紧过松,塞好后,以手提棉塞、管、瓶不下落为合适。棉塞的2/3应在管内或瓶内,上端露出少许棉花便于拔取。塞好棉塞的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆扎,准备灭菌。

8.培养基的灭菌

培养基的灭菌时间和温度,应按照各种培养基的规定进行,以保证灭菌效果及不损失培养基的必需营养成分。培养基经灭菌后,必须置30℃温箱中培养24 h,无菌生长者方可应用。

9.性状观察

制成的培养基应该是透明的,以便观察细菌生长性状以及其他代谢活动所产生的变化。

10.保存

制成的培养基保存环境为4℃冰箱,如制成平板则用塑料袋包装置冰箱保存,且配制好的培养基(尤其是糖发酵管)不宜久放,一般在两周内使用完为宜,因为培养基吸收空气中的二氧化碳,会使培养基变酸,从而影响细菌的生长。

11.培养基相关试剂的质量控制及阴、阳性对照菌株试验

对做生化反应的各类试剂,在配好后就均应进行各项必要的鉴定。用已知阴、阳性菌株进行对照试验。对于其他如氧化酶、触酶、染色液等也同样需要经鉴定后用于试验。

12.培养基制备记录

培养基制备时应做好培养基配置记录,内容包括配置时间、培养基的名称、溶质称量值、加水量、培养基pH值、高压灭菌方式及时间、配置人姓名。

食品微生物实验室培养基配置必须以保证食品微生物检测工作的顺利开展为目标,为提高食品微生物检验工作时效性、准确性,食品微生物实验室用到了很多培养基配置的相关设备,如电子天平、红外加热炉、pH计、重量稀释仪、全自动高压灭菌锅、培养基自动配置器等,这类设备也在向新型、高科技、自动化的方向发展,本节以下内容将介绍培养基配置相关设备的基础理论知识及标准操作程序。