透射电子显微镜成像原理详解

（一）衬度成像原理

1.衬度的定义　透射电子显微镜中，所有的显微像都是衬度像。衬度C是指两个相邻部分电子束强度I1与I2的差异：

光学显微镜的衬度是由于材料各部分反射光的能力不同而产生。在透射电子显微镜中，当电子逸出样品下表面时，由于试样对电子束的作用，使得透射到荧光屏上的强度是不均匀的，这种强度不均匀的电子像称为像衬度。透射电子显微镜的像衬度与所研究的样品材料自身的组织结构、采用的成像操作方式和成像条件有关。

2.衬度的类型　透射电子显微镜的像衬度来源于样品对入射电子束的散射。当电子波穿越样品时，其振幅和相位都会发生变化，从而产生衬度。因此，从根本上讲，透射电子显微镜的衬度可分为振幅衬度和相位衬度两种。通常情况下，这两种衬度会同时作用于一副图像，其中一种占据主导。而振幅衬度又可分为质厚衬度和衍射衬度。

（1）质厚衬度。质厚衬度是由于材料的质量厚度差异造成透射束强度差异而产生的衬度（主要是非晶材料）。样品中原子的原子序数不同，对电子的散射能力也不同。重元素比轻元素散射能力强，成像时被散射出光阑外的电子也越多。此外，随样品厚度增加，对电子的吸收越多，被散射到物镜光阑外的电子也越多，通过物镜光阑参与成像的电子强度就越低，因而样品图像上原子序数较高或样品较厚的区域较黑，而原子序数较低或样品较薄的区域较亮，如图3-18所示。

（2）衍射衬度。由样品各处衍射束强度差异形成的衬度称为衍射衬度（主要指晶体材料）。影响衍射强度的主要因素是晶体取向和结构振幅。对于没有成分差异的单相材料，衍射衬度是由样品各处满足布拉格反射条件的程度不同而形成的。如图3-19所示，晶体薄膜里有两个晶粒A和B，它们之间的唯一区别是其晶体学位向不同，其中A晶粒内的所有晶面组与入射束不成布拉格角，强度为I0的入射束穿过试样时，A晶粒不产生衍射，透射束强度等于入射束强度，即IA=I0，而B晶粒的某（hkl）晶面组恰好与入射方向成精确的布拉格角，而其余的晶面均与衍射条件存在较大偏差，此时，（hkl）晶面产生衍射，衍射束强度为Ihkl。假设样品足够薄，入射电子的吸收效应可忽略，则强度为I0的入射电子束在B晶粒区域经过散射后，成为强度为Ihkl的衍射束和强度为I0-Ihkl的透射束两部分。如果让透射束进入物镜光阑，而将衍射束挡掉，在荧光屏上A晶粒比B晶粒亮，就得到眀场像。如果把物镜光阑孔套住（hkl）衍射斑，而把透射束挡掉，则B晶粒比A晶粒亮，就得到暗场像。

图3-18　质厚衬度的成像光路图

图3-19　衍射衬度的成像原理

在眀场像形貌中，越明亮的晶粒，透过的电子越多，说明衍射束较弱，偏离布拉格条件较远；较暗晶粒的晶面都较好地符合布拉格方程，但其衍射束被光缆挡掉，无法参与成像。在暗场像中，像点的亮度直接等于样品上相应物点在光阑孔所选定的那个方向上的衍射强度。因而，眀场像与暗场像的衬度特征是互补的。正因为衍衬像是由于衍射强度差异所产生的，所以衍衬图像是样品内不同部位晶体学特征的直接反映。

（3）相位衬度。相位衬度是多束干涉成像。当让透射束和尽可能多的衍射束携带它们的振幅和相位信息一起通过样品时，通过与样品的相互作用，就能得到由于相位差而形成的能够反映样品真实结构的衬度（高分辨像）。如果样品厚度小于100nm，甚至30nm，就能够让多束衍射光束穿过物镜光阑彼此相干成像，像的可分辨细节取决于入射波被试样散射引起的相位变化和物镜球差、散焦引起的附加相位差的选择。

一束单色平行的电子波射入试样内，与试样内原子相互作用，发生振幅和相位变化。当其逸出试样下表面时，成为不同于原入射波的透射波和各级衍射波。但如果试样很薄，衍射波振幅极小，透射波振幅基本与入射波振幅相同，非弹性散射可忽略。当衍射波与透射波间的相位差为π/2，如果物镜没有相差，且处于正焦状态，光阑也足够大，这时透射波与衍射波可以同时穿过光阑相干。相干产生的合成波振幅与入射波相同，只是相位稍有不同。由于振幅没变，因而强度不变，所以没有衬度。要想产生衬度，必须引入一个附加相位，使所产生的衍射波与透射波处于相等或相反的相位位置，即让衍射波沿图x轴向右或向左移动π/2，这样，透射波与衍射波相干就会导致振幅增加或减少，从而使像强度发生变化，相位衬度得到显示，如图3-20所示。

图3-20　相位衬度形成示意图

（二）电子衍射

1.电子衍射原理　电子衍射是现代研究物质微观结构的重要手段之一。电子衍射分析可通过电子衍射仪或电子显微镜来实现。电子衍射分为低能电子衍射和高能电子衍射，两者的区别在于电子加速电压的不同。低能电子衍射加速电压较低，为10～500V，电子能量低，主要利用电子的波动性来进行表面结构分析。高能电子衍射的加速电压通常大于100kV。电子显微镜中的电子衍射就是高能电子衍射。普通电子显微镜的“宽束”衍射（束斑直径约为1μm）只能得到较大体积内的统计平均信息，而微束衍射（电子束＜1～50nm）可研究材料中亚纳米尺度颗粒、单个位错、层错、畴界面和无序结构，可测定点群和空间群。电子显微镜中电子衍射的优点是可在原位同时得到样品的微观形貌和结构信息，并能进行对照分析。电子显微镜物镜背焦面上的衍射图常称为电子衍射花样。电子衍射作为一种独特的结构分析方法，主要用于物相分析和结构分析，确定晶体位向，确定晶体缺陷结构及晶体学特征。

电子衍射的原理和X射线衍射相似，是以满足（或基本满足）布拉格方程作为产生衍射的必要条件。两种衍射技术得到的衍射花样在几何特征上也大致相似。单晶衍射花样由许多排列得十分规整的亮斑所组成，多晶体的电子衍射花样是一系列不同半径的同心圆环，而非晶体物质的衍射花样是一个漫散的中心斑点，如图3-21所示。(www.xing528.com)

图3-21　电子衍射图像

2.选区电子衍射　选区衍射就是在样品上选择一个感兴趣的区域，并限制其大小，从而得到该微区电子衍射图的方法。

图3-22为选区电子衍射的原理图。入射电子束通过样品后，一组平行散射束在物镜的后焦面上形成一个斑点，各斑点发射电子波在像平面上成像。如果在物镜的像平面处加入一个光阑，则光阑孔外的电子被光阑挡住、接地吸收，只有光阑孔范围内的电子能够通过光阑在像平面成像，成像电子仅来自于与光阑内图像对应的试样上的区域，这些电子在后焦面处形成斑点，试样其他区域对衍射斑点的贡献均在光阑孔之外，如图3-22所示。此时，进入衍射模式观察后焦面，在荧光屏上得到的衍射花样来自于样品上的成像区域，从而实现物像和结构的对应分析，这就是选区电子衍射。

图3-22　选区电子衍射

选区光阑孔径可调，一般为20～400μm，其位置可在像平面任意移动。若物镜放大倍数为50倍，则选用直径为50μm的选区光阑就可以选取样品上直径为1μm的区域。选区衍射所选的区域很小，因此能选择细小析出相进行分析，为研究细小单晶体结构提供了有利条件。在进行选区衍射时，物镜的像平面、中间镜的物平面和选区光阑的水平位置要尽可能调整到一个水平面上，操作中图像和光阑孔边缘都应准确聚焦。如果物镜的像平面和中间镜的物平面重合于选区光阑的上方或下方，尽管荧光屏上仍能得到清晰的图像，但所选的区域已经发生偏转而使衍射斑点不能和图像完全对应，形成所谓的选区衍射误差。

（三）提高生物样品图像反差的方法

生物样品主要由较轻的低原子序数组成，这些原子对电子的散射能力很小，尤其生物样品为超薄切片时，它的质量厚度极小。此外，制作超薄切片时通常把生物样品包埋在环氧树脂中，这些聚合树脂多为轻元素组成，这就造成样品与包埋剂二者质量厚度差异很小。由于以上原因，生物样品本身的固有反差很弱。因此，必须采取适当的措施，从制样处理和电子显微镜操作技术方面来提高图像的反差。

常用的提高生物样品图像反差的方法有以下几种。

（1）用重金属盐来染色，以增加样品某些结构的质量厚度。

（2）用重金属投影喷镀。

（3）选择小孔径光阑。物镜光阑孔径越小，图像的反差越大。但反差的提高并不与光阑的大小成正比。当光阑过小时，会造成图像亮度过暗，而且很容易产生污染或散射。所以在选择物镜光阑时，应兼顾其他成像因素。

（4）适当降低加速电压。电子散射角度的大小与加速电压的平方成反比。降低电子加速电压可以提高图像的反差。但加速电压降低时，低速电子波易受杂散电磁场干扰，同时，电子的穿透能力降低，色差增大，最终造成分辨率的降低。

（5）利用暗场显微方法。用直接透过电子通过光阑所造成的像为明场像，用散射电子所成的像为暗场像，而其反差相反。对于同一样品来说，明区与暗区反差大小的绝对值ΔI是一定的，即ΔI明=ΔI暗，当背景强度发生变化，ΔI明=ΔI暗时，暗场的反差（ΔI/ΔI暗）将大于明场的反差（ΔI/ΔI明）。因此，用暗场显微法可提高图像的反差。

（6）样品切片厚度对图像反差的影响。薄的切片电子易于透过，散射电子少，成像的亮度大、色差小、分辨率高。但过薄的切片，其质量厚度过于小，成像的反差太弱，不利于观察。所以，通常在保证一定分辨率前提下，选择适当厚的切片，可以增加图像的反差。

图3-23　物镜欠焦量示意图

（7）选择正确的欠焦量，可获得图像的最佳反差。调节物镜使图像稍欠焦或稍过焦，如图3-23所示，图像的反差即可显著增大。