己酸菌的选育与应用研究

江苏洋河集团有限公司陈翔、范文来和原无锡轻工大学生物工程院戴群、赵光鳌，利用生物工程技术，模拟老窖中微生物的生态分布及老熟机理，筛选出产己酸能力强的窖泥功能菌，优化窖泥配方，改造老化池口，提高洋河大曲产酒质量。

（一）材料与方法

1.分离样品取自洋河集团各酿酒车间的窖壁、窖底以及污泥。

2.培养基

平 板 分 离 用 培 养 基（ %）：K2HPO40.04，（pH4）2SO40.05，CH3COONa0.5，MgSO40.02，酵母膏0.1，琼脂2，调pH 至7.0～7.5。

穿刺培养基（%）：同上。

斜面保藏用培养基（%）：同上。

筛 选 用 培 养 基（ %）：K2HPO40.04，（pH4）2SO40.05，CH3COONa0.5，MgSO40.02，酵母膏0.1，CaCO31，乙醇2。

厌氧指示剂：用蒸馏水将10mol/L 的NaOH 液稀释到0.lmol/L、30mL0.5%美蓝稀释到100mL。100mL 含少量百里酚的蒸馏水加C6H12O690g。

3.实验方法

（1）分离样品

系列稀释：称取10g 泥样，置250mL 三角瓶中，加入100mL 水，搅拌成悬浮液。在80℃水浴处理10min，取出悬浮液0.5mL，用生理盐水稀释到10-1，10-2，10-3三种稀释度。

倾注平板：取培养皿若干，编号，选适宜的稀释度10-3，从中吸取1mL悬液，加入空皿中，然后将熔化、冷却到50～55℃的培养基倒入平皿。

培养基凝固后，将培养皿置于真空干燥器中，通入二氧化碳，在真空干燥器的一端管子插入装有厌氧指示剂的试管，直至变蓝，停止充气，于35℃下培养5d。(www.xing528.com)

画线分离方法：用接种针取一环菌，在平皿中画线，于35℃下培养5d。

（2）初筛方法：简单染色后，用显微镜观察，取生长较好的进入下一步培养。液体培养方法：在加入1%CaCO3一起灭菌后的空试管中，倒入培养基直到接近管口，取一环菌，接入试管，然后再加入2%的乙醇，塞上橡皮塞，于35℃下培养7d，然后再以10%的接种量于100mL 三角瓶中扩大培养。

（3）复筛：用比色法测定发酵液中的己酸含量。

（4）菌种保藏：斜面培养基厌氧培养后冰箱保藏。

4.结果与讨论

（1）微生物初筛：从洋河集团各车间老窖、新窖的窖壁、窖底以及污泥中取样25 个泥样分离，分得180 多株菌，其中有芽孢的杆菌有130 株，芽孢大于菌体的有42 株，而革兰氏染色阴性的有23 株。

（2）复筛：从初筛所得的23 株菌株中，得J7 己酸菌株。

（二）中试应用结果

经扩大培养后和二次和泥发酵，窖泥已经成熟，色泽乌黑，无原料本色，质地均匀，断面无气，有明显的老窖泥气味，镜检含丰富的梭状芽孢杆菌。

1.四大酯均不同程度地增长，其增长率分别为己酸乙酯为44.2%、乳酸乙酯为30.3%、丁酸乙酯为26.3%、乙酸乙醇为3.52%，其中己酸乙酯的增长率最为突出。

2.窖泥更新后酒的四大酯比例更趋于谐调。更新前己酸乙酯：乳酸乙酯：乙酸乙醇：丁酸乙酯为1：0.91：0.55：0.1。更新后己酸乙酯：乳酸乙酯：乙酸乙酯：丁酸乙酯为1：0.82：0.40：0.09。突出了洋河大曲酒应有风格，有效提高酒质。

3.提高名优酒率由原来的36.72%提高到43.36%，上升了8.64 个百分点。