选育耐酸性α-淀粉酶菌株

耐酸性淀粉酶因其能在极端酸性环境条件下保持敎高的酶活力而受到研究者的注意，日本以其传统烧酒和清酒工艺为研究重点，是研究耐酸性淀粉酶较早的国家。1962年，山田出黑曲霉产生的耐酸性α-淀粉酶的最适pH是4.0。随后不断从白曲霉发酵产物中分离纯化出在酸性条件下能保持高活力的耐酸性α-淀粉酶。研究和开发耐酸性淀粉酶，对简化工序、提高液化与糖化质量、提高成品得率、降低生产成本具有现实意义。

四川大学生命科学院胡欣洁、李凛、王忠彦、胡承，从醇醅中分离到一株产耐酸性α-淀粉酶的菌株，经鉴定为假丝酵母属的水生假丝酵母通过紫外线和硫酸二乙酯复合诱变使其产酶能力提高4 倍。

（一）材料和方法

1.淀粉厂附近酸性土壤、酒糟、醇醅。实验室配置酸性富集培养基。

2.培养基

（1）筛选培养基：玉米淀粉1%、蛋白胨0.5%，pH2.5～4.5。

（2）种子培养基：可溶性淀粉1%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%，pH4.0。

3.耐酸性α-淀粉酶产生菌株的筛选称取样品5g 加入装有50mL 无菌水的小三角瓶中，振荡均匀后，做浓度梯度稀释，得到不同稀释度的样品，将菌液涂布于pH 为2.5～4.5 的筛选培养基上进行培养。待菌体生长后，挑取有明显透明圈的菌株，后进一步纯化分离。

4.诱变

（1）菌液制备：利用接种环挑取斜面培养基上处于生长对数期的菌体转入10mL 无菌生理盐水中，充分振荡后，稀释菌液菌体浓度约为108个/mL，作为待处理的菌悬液。

（2）紫外线诱变：取上述菌液5mL，倾入直径为9cm 底部平整的平皿中，在磁力搅拌器缓慢搅拌条件下，紫外垂直距离30cm，照射0、30、60、90、120、150、180s 再做梯度稀释，取0.1mL 涂于筛选平板，30℃避光培养，统计诱变致死率，选择致死率为80%左右的剂量处理样品。

（3）DES-UV 诱变：经紫外线诱变后的正变株用磷酸缓冲液制备悬浮液，取5mL 与浓度为2%的DES 溶液混合，在3CTC 振荡0、2、4、6、8、10min，加入2%Na2S2O3终止反应，然后在紫外线灯下照射150s。做梯度稀释，取0.1mL 涂筛选平板，梯度稀释后涂平板，30℃避光培养5d，选择致死率为80%左右的剂量处理样品，根据多菌株出发原则，在经紫外线诱变的正变菌株中选取酶活力高的菌株进行DES-UV 复合。

5.酶活力测定方法

（1）所用试剂

底物溶液：0.5%可溶性淀粉溶液。

原碘液：称取0.5g 碘和5.0g 碘化钾研磨溶于少量蒸馏水中，然后定容到100mL。

稀碘液：取ImL 原鹏液稀释100 倍。

（2）酶液浸出：称取固体培养物5.0g，加入0.1mol/L pH 为4.0 的醇酸—醇酸钠缓冲液（0.5%NaCl）20mL，浸泡3h，过滤取上清液。(www.xing528.com)

③实验方法：底物5mL 在40℃水浴预热10min，加入酶液0.5mL，准确保温5min。用0.1mol/L 的HC1 终止反应。取0.5mL 反应液与5mL 稀释碘液显色，在620nm 处测光密度。以0.5mL 水代替0.5mL 的反应液为空白，以不加酶液（加同体的缓冲液）为对照。

（二）实验结果

1.实验菌株经分离纯化得到的ASA-1 菌株，其耐酸性淀粉酶活力为30.6U/g。

（1）培养和形态特征：菌落特征：菌落圆形，边缘整齐，乳黄色，质地光滑湿润，较厚。培养基上产生透明圈（3500×0.7）。

细胞特征：通过美蓝水浸片观察，细胞单个体较大，呈长圆形，平板培养条件下能见单极出芽和两极出芽现象，在液体培养条件下可见到多极出芽。

假菌丝形成实验：马铃薯培养基培养3d 后，假菌丝清晰可见。

子囊孢子形成实验：Gorodkowa 培养基、Kleyn 培养基、马铃薯培养基、石膏块培养基，培养均未见子囊孢子形成。

（2）生理生化特性

根据ladder 分类系统，初步确定ASA-1 属于假丝酵母属水生假丝酵母。

2.菌株诱变

（1）紫外线诱变：以野生菌株ASA-1 为出发菌株，进行紫外线诱变，照射不同时间及致死率结果。

选择致死率80%左右的剂量处理样品，即用紫外线灯照射样品150s 后，梯度稀释后涂布筛选，平板30℃避光培养70h，以透明圈直径与菌落直径比值为标准进行初筛，选取比值大的菌株进行固体发酵，培养70h 后，测酶活力。

（2）DES-UV 复合诱变：以野生菌株ASA-1 为出发菌株，先利用浓度为2%的DES，30℃振荡不同时间，然后在紫外灯下照射150s，统计致死率。

选择致死率80%左右剂量处理样品，即2%DES 溶液301 振荡6min 后，再用紫外灯照射150s。

经DES-UV 复合诱变，通过初筛和复筛后，得高产菌株ASA-UV86。

3.诱变菌株稳定性考察

将ASA-UV86 菌株在斜面培养上连续传代10 次，每次接种发酵测定酶活力。