窖泥微生物群落结构的研究现状与展望

窖泥微生物群落结构是指窖泥所有微生物种类及遗传变异和生态系统的复杂性总称。揭示窖泥微生物群落结构是发掘功能微生物资源的基础。由于酿酒微生态系统的复杂性，加之绝大多数微生物不可培养，近年的报道主要是基于分子生物学研究手段的免培养技术，如变性梯度凝胶电泳，基因文库和Illumina/454 测序等对窖泥微生物群落结构展开研究。

（一）窖泥微生物群落多样性

1.窖泥细菌群落多样性：细菌是酿造生产的主要参与者。虽然相关研究采用的窖泥样本和技术方法不同，但所报道的细菌群落结构具有明显相似性。真细菌主要分类于硬壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、放线菌门和互养菌门优势属有梭菌属、乳杆菌属、芽孢杆菌属、瘤胃球菌属、互营单胞菌属，Sedimentibacter 和Petrimonas。古菌主要分类于广古菌门，优势属为甲烷八叠球菌属、甲烷鬃菌属、甲烷杆菌属和甲烷短杆菌属。此外，Liu 等从种水平研究优势类群梭菌属的多样性，表明克氏梭菌、永达尔梭菌，C.ragsdalei 和C.autoethanogenum 为窖泥细菌基本成员，为菌株选育提供了一个方向。

另一方面，通过比较Zheng 等、Ding 等和汤斌等的报道看出，不同企业窖泥细菌群落结构可能存在显著差异。如泸州老窖窖泥细菌分类为8个科，包括梭菌科、乳杆菌科、互养菌科，鞘氨醇单胞菌科、瘤胃菌科，Clostridiales Incertae Sedis XI，Lanchnospiraceae 和Plannococcaceae；叙府酒业窖泥细菌归属于5 个科，包括乳杆菌科、梭菌科、互养菌科、紫单胞菌科和醇杆菌科；而古井贡酒窖泥细菌仅被精确分类于真杆菌、梭菌、乳杆菌和互营单胞菌4 个属。虽然研究方法不同可能造成结果出现偏差，但应注意的是，窖泥微生物群落结构差异可能是造成我国浓香型白酒风味多样化的主要原因。近年来，将酿酒微生物用于培养人工窖泥已成为主要的生产实践。以上研究提示，系统研究企业间窖泥菌群结构的差异，合理搭配和利用微生物资源是保持产品特色的关键。

2.窖泥真菌群落多样性：真菌是窖泥微生物的重要组成部分，具有较高生物量。但研究显示，窖泥真菌多样性较低，仅分类为威克汉姆酵母属、克鲁维酵母属，毕赤氏酵母属、假丝酵母属、接合酵母属、曲霉属，白地霉属和地霉属。研究者认为，这可能是由于真菌多为好氧微生物，窖池厌氧环境不利于其生长所造成。近期，本课题组利用DGGE 和Illumina 测序技术研究窖泥ITS 基因多样性，发现窖泥真菌分类为111 个属并归于子囊菌门、接合菌门、担子菌门、壶菌门其中大部分优势属与所报道的酒曲真菌群落一致。

重要的是，低龄和百年窖泥优势菌群结构存在显著差异，并且百年窖泥的假丝酵母属丰度显著较高。因此，虽然厌氧环境会抑制真菌生长，但酒曲丰富的真菌资源可维持窖泥真菌群落稳定发展。窖泥真菌之间、真菌与细菌之间是否存在相互作用以及由此可能对酒质存在的影响值得进一步研究。(www.xing528.com)

（二）窖泥微生物群落的演替

窖泥微生物演替是指随窖龄的推移，窖泥微生物群落和生态环境定向有序的发展过程。演替的主要标志是群落在物种组成上发生了改变。生产实践表明，窖泥越老，其发酵白酒的酒质越好。因此，研究窖泥微生物的演替有利于深入认识酿酒微生物发酵机理，揭示“老窖产好酒”的秘密。

2014年，℃ao 等利用454 测序技术首次系统研究了窖泥细菌在1～50年间的演替。该研究将演替分为3 个阶段：起始驯化期（l年）、演替期（1～25年）、成熟期（25年后）。3 个阶段均以优势菌群和化学成分的显著变化为特征。结果显示，窖泥pH，NH4+和乳酸的含量是影响细菌演替的主要因素。起始驯化期，窖泥富含乳杆菌属，乳酸的积累形成高酸度环境，使适应性低的菌群被淘汰。演替期，窖泥pH 值随乳杆菌的衰亡和NH4+含量的增加而上升，细菌多样性增加，拟杆菌门和螺旋体门大量繁殖；有机酸、Hz 和CO：的含量也有所增加，促进了能促己酸生成的产甲烷菌的生长。成熟期，细菌群落相对稳定，梭菌属IV 簇、梭菌科和Anaerobrancaceae 的丰度提高并与窖泥己酸含量呈显著正相关护，说明它们对己酸乙醇的生成具有积极作用。随后，Guo 等的研究显示50年后的窖泥细菌群落结构与Tao 等的报道基本一致，但拟杆菌门在50～440年仍大量增长，说明演替是非常漫长的过程。以上研究为解释“老窖产好酒”提供了理论基础，为功能菌株的分离提供了有利线索。此前虽有大量关于不同窖龄窖泥微生物群落结构的比较研究，但受样品规模的限制，绝大多数报道未能提供演替的详细信息。

（三）窖泥微生物群落结构与窖泥质量的关系

近年来，并购整合、兼并重组已成为白酒行业发展的主旋律。建立科学的窖泥质量评价体系可为企业在征地拆迁、并购重组、窖池抵押参保等过程中对窖池价值的客观评估提供依据。长期以来，窖泥质量主要依靠其感官特征和化学成分进行判定。近期研究显示，窖泥质量与其菌群结构存在密切联系。Liang 等发现正常窖泥细菌DGGE 的多样性和均匀度均高于退化窖泥；qPCR 结果显示，正常窖泥放线菌门的丰度也显著较高。Hu 等利用Illumina测序技术对不同质量等级（退化、正常和高质量）窖泥群落及其与环境因子的关系开展系统研究，发现梭菌纲、拟杆菌纲和产甲烷菌是维持窖泥生态平衡的主要类群，丰度与窖泥质量正相关，较高的pH 值、NH+和有效磷含量利于它们的生长；乳杆菌属、片球菌属和链球菌属的大量繁殖不利于窖泥生态平衡的保持。以上研究展示了不同菌群和窖泥质量存在的潜在联系，将来若能建立不同质量等级窖泥微生物群落丰度的置信区间，将有利于窖泥质量鉴定体系的完善。另外，Tao 等和Hu 等的研究均显示，优质窖泥以梭菌纲、拟杆菌门和产甲烷菌为优势菌群，近中性酸度和较高水平的NH4+含量利于酿酒有益微生物生长，这对人工窖泥的培养具有指导意义。