石墨烯的生物发育毒性研究：以斑马鱼为例

为避免有害的副作用，纳米颗粒的体内毒性研究必须在医学应用之前谨慎完成。在进行任何人类临床试验之前，应在啮齿动物和非啮齿类动物中进行体内预先临床安全性研究。有不少研究报道了石墨烯家族材料的毒性和生物相容性。与体外研究相比，剂量和表面修饰是决定纳米材料在生物体中的分布和毒性的两个主要考虑因素。本小节将讨论一些石墨烯基材料在体内毒性研究的例子。

一项研究[6]测试了不同剂量的GO（0.1mg、 0.25mg和0.4mg）通过尾静脉注入小鼠体内。当注射小剂量的GO（0.1mg和0.25mg）时，没有观察到明显的毒性反应；当注射剂量为0.4mg时，可以观察到小鼠虚弱和体重下降的现象。研究的9只小鼠中，有4只在给药的第一周死亡，通过病理学分析发现其气管出现阻塞并导致窒息。观察中发现小鼠的嗜中性粒细胞增多，上皮样肉芽肿与多核巨细胞和嗜酸性粒细胞的积聚，标志着出现了明显的炎症反应。实验还发现，大量的炎性细胞浸润于肺间质中，导致肺泡间隔增厚，肺泡间出现裂缝。大部分注射的GO主要聚集在肺、肝和脾中，在脑组织中没有发现，表明注射的GO不能穿透血脑屏障。另外，在肾脏中仅观察到少量的GO，表明GO不能通过肾脏排出。

纳米材料的表面修饰会影响其在动物体内的分布，进而影响其毒理学特性。大量研究表明，纳米材料的表面修饰可以提高其生物相容性和延长血液滞留时间。有研究[24]使用了葡聚糖包裹石墨烯，将葡聚糖官能化的石墨烯纳米薄片以1～500mg／kg（体重）的浓度注射到大鼠的尾静脉中。研究发现，最大耐受量为50～125mg／kg（体重）。高剂量给药会导致大鼠的死亡，心源性死亡和肺淤血是主要的死亡原因，在实验中没发现体重或者行为的变化。

在另一项研究[25]当中，将125I放射性标记的PEG功能化的GO和rGO灌胃给小鼠并观察其在生物体内的分布。灌胃4h后，在胃和肠中观察到了高水平的放射性，然后放射性在正常饲喂1天后减少。这表明PEG修饰的石墨烯基材料没有被消化系统有效吸收，并且纳米颗粒在饲喂后可以排泄出来。该项研究也探究了同一材料在腹腔给药的情况下在生物体内的分布。与口服不同的是，腹腔注射导致石墨烯纳米颗粒在肝脏和脾脏中出现了富集，并且在注射30天后仍能观察到沉积在肝脏和脾脏上的微粒。巨噬细胞通过网状内皮系统摄取石墨烯纳米颗粒，在腹腔注射的结果中发挥了重要的作用。

类似地，还有一项研究[9]将Pluronic分散的石墨烯薄片通过气管滴注给小鼠施用。滴注24h后可以观察到小鼠肺炎的症状。在给药21天后，可观察到严重的肺部炎症，蛋白质渗入肺泡腔内，并观察到炎症因子水平的升高。另外血浆凝血酶和抗凝血酶复合物显著增加，这将提高心脏病发作的风险。此外，聚集的大尺寸石墨烯薄片不能被巨噬细胞清除，这些薄片引发了支气管的阻塞，导致了周围组织的纤维化和炎症。

为了研究GO的眼内生物相容性，有研究者在兔的眼球上进行了实验。向兔眼的玻璃体内注射了GO，注射后眼球外观、眼压、视力和眼科切片均没有发现明显的变化。这项研究表明，GO可以作为治疗眼底肿瘤的药物载体[26]。(www.xing528.com)

研究表明PEG官能化的石墨烯纳米薄片静脉给药的药代动力学结果符合两室模型[25]，第一阶段和第二阶段的血液循环半衰期分别为（0.39±0.097）h和（6.97±0.62）h。注射的石墨烯纳米薄片可在许多器官中观察到，但主要分布在网状内皮系统上，并最终通过肾脏和粪便排出。

类似地[27]，将用DOTA（1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸）修饰的GO静脉注射给小鼠，在注射后1h，膀胱中观察到明显信号。肝脏的摄入发生在注射后4~24h，24h后开始在脾脏上出现GO颗粒。该研究说明GO似乎可以从尿液中排出，可能是因为小而薄的GO卷起来可以通过肾小球，而较大的GO则被脾细胞吞噬。

尽管使用放射性标记技术进行石墨烯的长期体内生物分布研究比基于荧光的方法值得信赖，但是这种方式需要监测放射性物质在体内条件下的稳定性。因此，直接观察石墨烯基材料是研究其从体内清除过程的最可靠的方式。

到目前为止，对石墨烯毒性的研究大都集中在石墨烯基材料在生物体内的分布和系统毒性上，但是发育毒性是纳米材料毒性研究较少的领域之一。关于石墨烯基材料影响胚胎发育的文献相对较少。有一项研究[28]将斑马鱼胚胎暴露在50mg／L的GO环境中，鱼卵孵化变慢，胚胎还表现为一些形态上的缺陷，比如弯曲的脊柱和尾部的畸形等，这意味着石墨烯基材料存在潜在的生物发育毒性。