石墨烯基材料的生物效应研究

GO和rGO材料在研究中都被发现具有一定的毒性[细胞毒性、脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）损伤和氧化应激]，但两者的毒性机理却不尽相同。亲水的GO的毒性主要表现为和还原型辅酶Ⅱ（Reduced Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate，NADPH）氧化酶相关的活性氧（ROS）的形成，并引起抗氧化剂、DNA修复及凋亡相关基因的高度失调。而疏水的rGO被发现其通常仅吸附在细胞表面，基本不参与ROS的产生，对基因的调控影响也很小。对全基因表达和细胞信号通路的研究表明：对于GO，经转化生长因子-β1（Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1）参与的信号传递通路在其毒性机理上起到了重要的作用；对于rGO，其产生宿-主病原体（病毒）相互作用及先天性免疫反应则是通过核因子-κB（Wuclear Factor-κB，NF-κB）参与的信号传递通路起作用的。

总而言之，GO和rGO本身结构和特性的不同导致了它们具有不同的毒性。有研究表明这一差异与石墨烯基材料的表面氧化态和碳自由基的含量有关[2]，碳自由基的密度越高其细胞毒性表现得越明显。除此之外，各种营养物质的吸附也可能是造成石墨烯基材料具有毒性的另一个因素。石墨烯基材料对吸附其上的细胞毒性反应主要表现为限制细胞营养物质的利用率和促进ROS的产生[3]。此外，一些可能对细胞活性有影响的氨基酸和生物分子会被吸附到石墨烯基材料的表面，这也许会对细胞的培养产生一定的影响[4]。图9-2为石墨烯对哺乳动物细胞的毒性机制。石墨烯可以通过不同的方式进入细胞，其中直接穿透细胞膜的方式会导致细胞膜的物理损伤。一旦进入细胞，石墨烯会导致ROS含量增加，诱发氧化应激，进而导致线粒体膜电位发生改变。石墨烯作为电子受体，可以干扰电子传递链，从而抑制三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP）的合成。ROS含量的增加会导致DNA的损伤；细胞释放的炎症因子会导致炎症反应，DNA损伤、氧化应激和炎症反应最终将导致细胞的凋亡。

图9-2　石墨烯对哺乳动物细胞的毒性机制[5]

在GO对人真皮成纤维细胞（Human Dermal Fibroblast，HDF）的毒性研究中[6]，将HDF和不同浓度的GO（10 μg／mL、20 μg／mL、50 μg／mL、100 μg／mL）一起培育24h。GO浓度为50 μg／mL时，发现了明显的细胞毒性，细胞的存活率降低，凋亡率升高。观察表明，进入细胞的GO大部分分布在细胞质中，只有少量的GO进入细胞核内。细胞质中的GO则主要分布在溶酶体、线粒体和内质网内。细胞摄入的GO的量会随着GO的浓度和细胞培养时间的增加而增加。GO的摄入还会导致细胞黏附性降低，进而导致细胞从培养皿的壁上脱落。一些与细胞黏附性相关的蛋白，如层粘连蛋白（Laminin）、纤维粘连蛋白（Fibronectin）和黏着斑激酶（Focal Adhesion Kinase，FAK），在和GO共培养的细胞中的表达明显降低。另外实验中还发现一些类似凋亡形态的细胞，这些细胞形成了包裹GO的囊泡，细胞的边界变得不清晰，细胞变圆且从培养皿上脱落。

对于石墨烯基材料体外毒性的研究表明，GO会导致氧化应激相关的细胞毒性。即使在很低的GO浓度下，虽然A549细胞的活性没有受到明显的影响，但是细胞中ROS浓度却显著升高[7]。在HepG2细胞的研究中，细胞分别与GO和羧基化石墨烯纳米薄片共同培养，结果显示细胞中的ROS的含量随着石墨烯基材料的浓度和细胞培养时间的增加而升高。即使在很低的浓度下（4 μg／mL），这两类纳米材料仍能通过直接穿透磷脂双层膜的方式进入细胞，从而引起细胞膜的损坏。有趣的是，这些细胞可以产生一些后续的预防措施，防止石墨烯基材料对细胞产生进一步的损伤，比如为防止更多的石墨烯基材料穿透细胞膜进入细胞内，细胞膜上会生成厚的中间纤维（Intermediate Filament，IF）来增强细胞膜的强度[8]。一旦进入细胞内，GO和羧基化石墨烯纳米片便会被细胞质中的囊泡包裹，从而避免与细胞内的其他细胞器相互作用，降低对细胞的损伤程度。

GO在细胞内会导致线粒体的呼吸率升高，从而导致细胞ROS含量升高，在这一过程中，线粒体扮演了重要的角色。有研究表明[9]，GO可在细胞呼吸作用的电子传递链中充当电子供体，为一些蛋白复合体提供电子，即提高了整体的呼吸率水平，从而导致细胞内的ROS含量的提高。暴露在GO环境时，细胞内ROS增加，抗氧化酶、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性降低，产生了氧化应激，最终可能会导致细胞的凋亡。

总之，不同类型的细胞在与石墨烯基材料接触的过程中，产生的毒性反应也不尽相同。在聚乙二醇修饰的石墨烯纳米带的毒性研究中，不同的细胞系（如海拉细胞、NIH-3T3细胞和MCF-7细胞）显示出不同的毒性反应。其中海拉细胞即使在该纳米材料浓度很低的条件下，也容易受到影响。研究还表明细胞摄入的该纳米材料的总量越大，毒性也变得越明显[10]。

在细胞与石墨烯纳米颗粒接触的过程中，通常可以观察到线粒体膜电位的去极化。该现象是由于线粒体的结构或功能的完整性受到了破坏，这种破坏最终会导致ROS的产生和细胞凋亡因子的释放。据报道[11]，原始石墨烯的细胞毒性主要表现为可以激活一些促凋亡因子并且增大线粒体的通透性，破坏了线粒体膜的完整性。随着这些促凋亡因子从线粒体释放到细胞质当中，一系列的凋亡反应被激活，并最终导致细胞的凋亡。

有研究证实，石墨烯可以干扰电子传递链中的蛋白复合物的正常工作[12]。由于石墨烯的特殊电学特性，石墨烯可以破坏电子传递链中的铁硫簇的电子传递。电子传递链活动的减弱将直接抑制ATP的合成。这一发现为抗肿瘤提供一个新的思路，石墨烯基材料进入细胞可以导致ATP合成的减少，ATP不足会导致纤维状肌动蛋白（F-actin）的合成减少，造成细胞形成较少的板状伪足，最终影响肿瘤细胞的迁移和侵袭。此外，GO在溶酶体内的聚集以及对线粒体的损坏会导致细胞的代谢紊乱，最终引起细胞的死亡。(www.xing528.com)

研究石墨烯纳米基材料和红细胞的相互作用具有重要的意义，因为纳米微粒在循环系统中不可避免地遇到红细胞。溶血实验是评估纳米微粒的红细胞生物相容性的方法中使用最广泛的方法。石墨烯的表面电荷量、含氧量和粒径等因素决定了其血液相容性。GO和石墨烯薄片（Graphene Sheet，GS）都会导致红细胞的溶血，其中GO的溶血现象更明显。GO的负电基团和红细胞膜上的正电基团相互吸引，使得GO在红细胞的细胞膜上吸附，从而使得溶血变得更加严重。GS则由于其含氧负电基团较少，不容易吸附到红细胞表面，但实验中发现GS可引起凝血反应。在GO上包覆一层生物相容的甲壳质可以通过屏蔽静电作用降低其在红细胞上的吸附，减弱溶血反应[3]。

有研究强调[13]，GO在应用到生物医学领域之前，其促血栓活性必须得到准确评估。该研究观察到，GO可以通过增强纤维蛋白原与细胞表面整联蛋白受体的结合来引起血小板的聚集。GO通过增加细胞内钙水平和激活Src激酶（一种非受体酪氨酸激酶）诱导血小板活化，激活的血小板通过释放腺苷二磷酸（Adenosine Diphosphate，ADP）和血栓素A2，最终引发一系列的凝血反应。该研究还观察到注射250 μg／mL的GO会导致小鼠肺栓塞。

即使石墨烯浓度在亚细胞毒性浓度（20 μg／mL）以下，石墨烯也被报道可通过触发促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen Activated Protein Kinase，MAPK）和TGF通路来诱导巨噬细胞的死亡，它还通过活化NF-κB和Toll样受体（Toll-like Receptor，TLR）介导的途径来诱导几种细胞因子和趋化因子的释放。用亚细胞毒性浓度的石墨烯处理巨噬细胞，会增强促炎性细胞因子的表达和释放。mRNA水平的研究表明，暴露在石墨烯中，巨噬细胞内三种促炎性细胞因子IL-1β、诱导型一氧化氮合酶（inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS）和环氧合酶（Cyclooxygenase，COX-2）的基因表达水平会提高。石墨烯处理也会影响细胞内的纤维状肌动蛋白合成并诱导细胞膜皱褶。石墨烯还会影响巨噬细胞的伪足的形成，降低细胞的黏附性[14]。

还有研究报道了类似的结果，用石墨烯纳米片处理THP-1细胞，一些炎症因子的基因表达水平会升高[15]。

巨噬细胞暴露在GO下，还会通过TLR相关的通路产生细胞自噬[16]，TLR 4和TLR 9是该过程中被显著激活的两种受体，这两个受体的激活将会激活MyD88和TRAF-6，最终促进自噬体的形成。GO处理下，细胞内的NF-κB的抑制剂I-κB将会磷酸化，会导致I-κB泛素化和被蛋白酶溶解，从而释放出游离的NF-κB。游离的NF-κB可以从细胞质迁移到细胞核，并和靶基因的启动子区域结合，从而激活其转录[17]。NF-κB主要激活干扰素（Interferon-γ，IFN-γ）和肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）的转录。细胞暴露在GO后，细胞自噬的标志性基因如Beclin-1和LC3-Ⅱ也会有明显的表达。

光动力学治疗是一种使用光敏剂的技术，光敏剂在接受光照射时激活并产生单线态氧，可以用来选择性地杀死肿瘤细胞[18]。石墨烯量子点（Graphene Quantum Dot，GQD）可以在光激发下产生单线态氧，故也可以作为光敏剂，用于光动力学治疗。GQD具有优异的光致发光特性，并且有接受或提供电子的能力。GQD本身可以作为ROS的猝灭剂，同时在有蓝光照射的条件下又可以产生ROS[19]。在光刺激下，GQD可以激活细胞的凋亡。GQD的细胞毒性主要是由于产生超氧阴离子和单线态氧，从而产生氧化应激，然后进一步引发细胞的自噬。实验表明，GQD可以用于光动力学治疗来消除体内不需要的细胞，但其潜在的毒性仍需要得到足够的关注。

研究发现原始石墨烯通过激活MAPK的信号通路来诱导细胞凋亡[11]。暴露于本征石墨烯中，巨噬细胞中会产生ROS，进而激活细胞凋亡信号调节激酶1（Apoptosis Signal Regulating Kinase 1，ASK1），该激酶进一步激活JNK和p38的MAPK通路。激活的p38会进入细胞核中，促进MAPK活化的蛋白质激酶2（MAPK-Activated Protein Kinase 2，MK2）的表达，然后诱导TNF-α的合成。该研究还证明了本征石墨烯也可以通过TGF-β诱导细胞凋亡。暴露于石墨烯后，TGF-β激活Bcl-2家族的一些促凋亡因子来激活调节细胞凋亡的Smad蛋白，从而引发细胞的凋亡。

纳米微粒诱导的DNA损伤可以通过单细胞凝胶电泳（Single Cell Gel Electrophoresis，SCGE）实验进行研究。该方法可用于观测DNA单链和双链的断裂[20]，受损的DNA链在电泳时滞后并形成彗星样的尾部，尾部的长短对应于DNA损伤的严重程度。有研究报道GO对细胞的遗传毒性与浓度相关[21]，在SCGE实验中观察到了尾部长度随着GO浓度增加而增长的现象。

体外诱变研究表明[22]，GO会和基因组DNA相互作用，原基因组DNA的含量随着GO的浓度增加而减少，原基因组DNA含量在GO浓度达到600 μg／mL时完全消失。即使浓度在纳克每毫升量级时，GO也能诱导37%的突变。主要是T→C、C→T、G→A、A→G、G→T、A→T、A→C的突变和G的缺失。此外，在DNA损伤控制、细胞周期、代谢和凋亡中起关键作用的基因表达模式似乎也受到了影响。研究者在小鼠暴露于GO环境的实验中，可以观察到随着GO浓度的增加，细胞中的微核形成量也在增加，这表明GO是一种有效的诱变剂。GO的平面结构非常类似于DNA的嵌入剂，因此它可以插入碱基之间，影响遗传信息的正常传递。另外，还有研究报道用PEG修饰GO也可以阻滞细胞周期进而引起细胞的凋亡[23]。