基于石墨烯的基因输送技术优化方案

石墨烯基材料作为载体应用于基因递送，源于其与核酸（DNA、RNA）的强烈相互作用，这种相互作用主要表现为以下几种独特的模式：① 相较于双链DNA（double-stranded DNA， dsDNA），石墨烯基纳米材料与单链DNA（single-stranded DNA， ssDNA）之间存在着更强的非共价作用力[22]，因而优先选择性吸附ssDNA，利用选择性吸附能力以及石墨烯的荧光猝灭能力，可用于DNA的检测；② 石墨烯基材料可使用聚合物如壳聚糖、聚酰胺-胺（Polyamidoamine， PAMAM）和聚乙烯亚胺（PEI）等进行修饰，获得带正电荷的表面，从而与带负电荷的外源基因通过静电相互作用形成复合物，同时，功能化修饰也可降低石墨烯的团聚及细胞毒性[23]；③ 石墨烯可以对负载的外源基因进行空间保护，使其免受核酸酶的影响[24]；④ 氧化石墨烯因其平面芳环结构有利于嵌入DNA双链中，可作为DNA嵌入剂引入DNA酶切体系，同时，氧化石墨烯表面上的含氧基团提供了更多的化学修饰和反应位点[25]。石墨烯与DNA／RNA相互作用的独特模式为基因递送提供了可能。

在氧化石墨烯片层的边缘具有大量的羧基，表面也含有环氧基和羟基，这些含氧官能团既可增加石墨烯的可加工性和溶解性，又可为进一步的化学修饰提供反应位点。因此，大量研究集中于氧化石墨烯的功能化或表面修饰。有研究表明GO与质粒DNA（plasmid DNA， pDNA）间存在着π-π相互作用，同时，功能化修饰的氧化石墨烯能够有效缩合pDNA，形成GO-pDNA纳米复合物[23]，从而保护基因并介导基因进入细胞[26]。

保护核酸免受脱氧核糖核酸酶（Deoxyribonuclease， DNase）或核糖核酸酶（Ribonuclease，RNase）的降解是研究基因递送系统的主要内容之一。Tang等[22]发现吸附在石墨烯表面上的ssDNA可以被有效地保护而免受脱氧核糖核酸酶I（Deoxyribonuclease I，DNase I）的切割（图5-8），这对于生物检测以及处在复杂的细胞和溶液环境中的基因递送系统来说是鼓舞人心的结果。羧基荧光素标记的ssDNA1在引入官能化的石墨烯后荧光强度显著降低；但在荧光素标记的ssDNA1-石墨烯溶液中加入互补的ssDNA2后，荧光强度显著增加，表明了互补的ssDNA2与ssDNA1结合形成dsDNA，使得吸附在石墨烯表面的ssDNA1解吸。同时，Tang等利用核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance， NMR）和圆二色光谱（Circular Dichroism，CD）技术，进一步研究了DNA和石墨烯之间的相互作用。实验研究表明，ssDNA被迅速吸附到官能化的石墨烯表面，形成较强的分子间相互作用，这种紧密结合从空间上阻止了DNase I降解DNA。Xu等[27]将GO和DNA通过三维自组装的方式形成了多功能水凝胶。实验中，将dsDNA与GO均匀混合并在90℃加热，使dsDNA解链为ssDNA，原位形成的ssDNA通过非共价相互作用桥接到GO上，继而从均匀混合物转化为了稳定的水凝胶，该水凝胶还展现出较高的机械强度，证明了ssDNA与GO之间存在着较强的相互作用。

图5-8　石墨烯对ssDNA的吸附和影响示意图[22]

许多研究表明外源基因负载到载体上主要是通过带负电的基因和带正电的载体之间的静电相互作用。然而，基于石墨烯的纳米材料是不带正电的，因此需要对石墨烯基材料进行修饰，以获得带正电的表面[20]。Feng等[28]对不同相对分子质量（10kDa和1.2kDa）PEI功能化的GO的基因递送进行了相关研究。研究显示GO-PEI复合物的细胞毒性显著降低，如在海拉细胞中所证实的，阳离子GO-PEI复合物能够进一步与阴离子pDNA结合，用于转染增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP）基因。其中，低相对分子质量的裸PEI（1.2kDa）具有非常低的转染效率，而GO-PEI（1.2kDa）可以进行高效率的EGFP基因转染；另一方面，与高相对分子质量的裸PEI（10kDa）相比，GO-PEI（10kDa）既表现出相似的高EGFP基因转染效率，同时细胞毒性更低。研究结果表明石墨烯基纳米材料作为一种新型的基因递送载体，具有低细胞毒性和高转染效率，有望在未来应用于基于非病毒的基因治疗中。Hu等[23]通过静电自组装制备了叶酸（Folic Acid， FA）共轭的三甲基壳聚糖（Folate Conjugated Trimethyl Chitosan， FTMC）／GO纳米复合物（FTMC GO Nanocomplexes， FGNC），如图5-9所示。其中，三甲基壳聚糖（Trimethyl Chitosan， TMC）与氧化石墨烯的结合可减少氧化石墨烯的聚集，采用叶酸修饰三甲基壳聚糖，可被海拉细胞表面的叶酸受体识别，促进癌细胞特异性内吞，以提高基因递送靶向效率。在FGNC对pDNA的负载和释放方面，琼脂糖凝胶电泳检测结果显示FGNC中存在的FTMC可以阻止pDNA的迁移并促进pDNA的缩合，证明了FGNC对pDNA的有效负载。同时，研究表明在磷酸盐缓冲液（PBS）中，体外72h pDNA的累积释放量达到31.1%，证明了FGNC载体可有效释放pDNA，显示出FGNC作为基因递送载体具有极大潜力。

图5-9　FGNC的合成示意图[23]

Liu等[29]通过石墨烯表面吸附油酸，并通过油酸与树枝状高分子PAMAM的共价相互作用，最终形成了石墨烯-油酸-PAMAM复合物作为基因递送载体（图5-10）。石墨烯-油酸-PAMAM复合物在水溶液中表现出良好的分散性，并且与海拉细胞具有良好的生物相容性，但在浓度大于20 μg／mL时对MG-63细胞显示出细胞毒性。当石墨烯-油酸-PAMAM与增强型绿色荧光蛋白pDNA（pDNA of EGFP， pEGFP-N1）的质量比为4∶1时，制备的石墨烯-油酸-PAMAM-pEGFP-N1复合物对海拉细胞的基因转染效率达到18.3%。

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图5-10　石墨烯-油酸-PAMAM复合物合成示意图[29]

CpG寡脱氧核苷酸（CpG Oligodeoxynucleotide， CpG ODN）可引起免疫应答，是一种极具潜力的免疫治疗试剂。Zhang等[30]将壳聚糖（Chitosan， CS）修饰的GO（GO-CS纳米复合物）用于CpG寡脱氧核苷酸的递送（图5-11）。研究发现GO-CS纳米复合物可负载CpG ODN，并促进CpG ODN被细胞摄取，可进一步诱导免疫反应的产生并释放细胞因子白细胞介素-6（Interleukin-6， IL-6）和肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α， TNF-α），从而证明了GO-CS纳米复合物可以作为纳米载体以提高CpG ODN的递送效率。

图5-11　GO-CS纳米复合物载体的合成及细胞内递送CpG ODN的示意图[30]

光热治疗和基因递送的结合为肿瘤治疗提供了新思路。其中，石墨烯基材料是光热治疗的重要候选材料。GO可利用聚乙二醇进行修饰，以提高生物相容性和负载能力。Yin等[31]利用FA共轭的氨基化聚乙二醇单甲醚（NH2-mPEG-FA）修饰GO，形成FA-PEG-GO复合物。之后将FA-PEG-GO复合物与阳离子聚合物聚（丙烯胺盐酸盐）（Poly-allylamine Hydrochloride，PAH）结合，形成PAH-FA-PEG-GO复合物，以提高转染能力。再将该复合物与HDAC1 siRNA和K-Ras siRNA（可分别沉默HDAC1基因和G12C突变的K-Ras基因）结合，进行双siRNA递送（图5-12），以实现对胰腺肿瘤细胞MIA PaCa-2的双重基因沉默，即引起细胞凋亡、增殖抑制和细胞周期阻滞。同时在近红外照射下实现光热治疗，研究结果显示复合物可实现较高的细胞摄取效率，基因递送和光热治疗的结合可有效抑制肿瘤增长。

图5-12　PAH-FA-PEG-GO复合物的合成及基因负载过程[31]

在最近的研究中，Lázaro等[32]利用氧化石墨烯介导siRNA的细胞内递送，以评估无表面修饰的氧化石墨烯的能力。研究将无表面修饰的GO与siRNA在10∶1、20∶1和50∶1的质量比下形成稳定的复合物，小鼠胚胎成纤维细胞暴露于其中，暴露4h复合物即迅速内化，此时，细胞内siRNA水平与脂质转染试剂递送的siRNA的水平相当。但在细胞内化过程中，siRNA可能无法有效地从氧化石墨烯晶格中释放出来，因此无法发挥作用，转染后细胞内siRNA水平迅速下降，而氧化石墨烯则被隔离在不同的胞内囊泡中，这可能是因为GO-siRNA复合物缺乏生物学效应（即基因沉默）。该研究强调了无表面修饰的GO作为非病毒基因递送载体具有潜力，但需要进一步优化载体，进行阳离子功能化修饰，从而使核酸有效释放，实现siRNA介导的基因沉默。

除了基因的递送之外，还可以使用基于石墨烯的载体材料递送蛋白质用于肿瘤治疗。Shen等[33]利用非共价相互作用将核糖核酸酶A （Ribonuclease A， RNase A）和蛋白激酶A（Protein Kinase A， PKA）分别负载到GO-PEG上，并递送至细胞中，保护蛋白质免受酶促水解并保持了其细胞内的生物学活性。