光学成像技术在microRNA研究中的重要应用

石墨烯基纳米材料被广泛应用于光学成像中，主要包括荧光成像（Fluorescence Imaging）、双光子荧光成像（Two-photon Fluorescence Imaging，TPFI）及拉曼成像（Raman Imaging）等。GQD由于其固有的光致发光效应，可用作荧光成像的光致发光探针。氮掺杂的GQD（N-GQD）表现出强双光子吸收截面，并被证明是用于TPFI的高效双光子荧光探针[21]。对拉曼成像来说，金属纳米颗粒（金或银）可以进一步增强GO的固有拉曼信号（1600cm－1附近的G峰和1350cm－1附近的D峰），因此可以用于表面增强拉曼散射（Surface-Enhanced Raman Scattering，SERS）成像[9]。

（1）荧光成像

荧光成像是一种基于荧光探针发射光子的非侵入性成像技术。基于纳米氧化石墨烯（nGO）的固有光致发光，聚乙二醇（PEG）修饰的纳米氧化石墨烯（nGO-PEG）被成功用于近红外区对细胞进行的荧光成像[22]。但是由于nGO-PEG荧光成像的量子产率低，限制了其在动物体内荧光成像的应用。许多研究团队利用有机荧光染料将GO／rGO功能化，制备有机荧光染料-GO／rGO复合材料，以用于在体和离体的荧光成像。例如，Liu研究团队用Cy7去结合nGO-PEG，开发了一种近红外染料——nGO-PEG-Cy7，其可以用于肿瘤异种移植小鼠的在体荧光成像，由于肿瘤的高渗透长滞留效应，nGO-PEG-Cy7在肿瘤处高浓度聚积[10]。对于GO／rGO的染料标记，荧光染料与GO／rGO之间的连接（如PEG）对于防止荧光染料的荧光猝灭至关重要[23]，因为荧光猝灭、光漂白等缺点都会影响荧光标记的应用。由于有机荧光染料的潜在光漂白，一些无机纳米材料也已被用于与GO／rGO复合，以用于荧光成像。除了nGO和GO／rGO之外，其他石墨烯基纳米材料也可用于荧光成像。例如，Nurunnabi等制备了近红外石墨烯纳米颗粒（GNP），其可用于深部组织和器官的非特异性和非侵入式光学成像，经细胞活性实验证明，这种GNP几乎没有任何细胞毒性。图4-2为小鼠尾静脉注射近红外GNP后的荧光成像，非特异性纳米颗粒在许多可能的位点累积[24]。除此之外，GQD由于其优异的光致发光性能也被广泛应用于荧光成像，并且相比于传统的含有重金属元素的半导体量子点，GQD不会对人体健康造成危害，因此具有极大的应用前景。

图4-2　小鼠尾静脉注射近红外GNP后侧面（a）和正前方（b）的荧光成像，可以看到造影剂注射后荧光强度随着时间逐渐减弱；（c）不同器官的离体成像[24]

最新研究表明，GO在RNA荧光成像中也可以发挥重要的作用。在microRNA相关的生理与病理过程研究中，细胞和活体水平的microRNA的原位成像至关重要。然而，目前常用的成像方法信噪比普遍较低，对成像质量和灵敏度造成了极大的影响。针对这个问题，Yang等利用GO增强了分子信标（Molecular Beacon，MB）信号分子的猝灭，开发了一种对microRNA进行活体荧光成像的方法，结果证明其具有很高的灵敏度[25]。通过将两个Cy5分子偶联到MB的两个末端得到了2Cy5-MB，自猝灭效应会减弱两个Cy5分子的荧光强度，吸附在GO表面后，通过荧光共振能量转移进一步增强了分子的荧光猝灭，这种双猝灭作用使荧光背景得到了显著的降低。当有microRNA分子存在的情况下，能同时恢复两个Cy5分子的荧光信号，显著增强了信号-背景比，从而使检测灵敏度得到极大的提升。

（2）双光子荧光成像

近年来双光子荧光成像（TPFI）在基础研究中受到了广泛的关注与应用。跟单光子荧光成像相比，TPFI具有较小的自发荧光背景和较大的成像深度（由于近红外光的低瑞利散射和低生物组织吸收），TPFI的光漂白和光毒性更小，因为不需要共焦小孔，TPFI可以使用全场探测的方式收集尽可能多的荧光信号[2]。另外，TPFI采用超短激光脉冲作为激发光源，在保持较高的峰值功率的同时，具有较低的平均输出功率，从而能有效减弱激光对生物样品的热损伤，对生物组织来说比较安全。并且双光子非线性激发模式具有更高的空间分辨率。此外，双光子激发波长为700～1350nm，此波段光在生物组织中的吸收和散射较小，可以达到更大的穿透深度，因此它非常适合于对深部器官和组织进行成像，可以用于对生物样品深部位置进行各种细胞水平和亚细胞水平的高分辨成像和分析[2，3]。

近些年来，包括碳点（C-Dot）、GO和GQD在内的碳基纳米材料在TPFI领域引起了研究者们极大的兴趣。Wang和Gu等首次报道了具有强双光子发光性质的转铁蛋白功能化的光学探针——GO-PEG，及其用于三维TPFI和激光引导的癌症显微手术，并且该探针不会发生光漂白[26]。之后，Gong研究团队开发了氮掺杂的石墨烯量子点（N-GQD）作为高效双光子荧光探针，其可用于细胞和深部组织成像[27]（图4-3）。用二甲基甲酰胺作为溶剂和氮源，通过溶剂热法成功制备了平均尺寸约为3nm的N-GQD。图4-3（b）为N-GQD的单光子荧光（One-photon Fluorescence，OPF）光谱与双光子荧光（Two-photon Fluorescence，TPF）光谱，在800nm飞秒脉冲激光激发下，N-GQD的最大双光子荧光发射波长与N-GQD的最大单光子荧光发射波长几乎相同，但TPF的光谱带宽更窄。如图4-3（d）所示，即使在1800μm的深度，生物组织仿体中的N-GQD仍然有着明显的TPF信号，尽管荧光强度显著降低，但是还是可以被识别。相较之下，单光子荧光成像（One-photon Fluorescence Imaging，OPFI）的最大穿透深度仅为400 μm。显然，使用N-GQD作为荧光探针的TPFI特别适用于深部生物组织和结构的活体研究。

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图4-3　N-GQD作为高效双光子荧光探针用于细胞和深部组织成像

（a）N-GQD化学结构示意图；（b）N-GQD的单光子荧光光谱（蓝色，OPF）与双光子荧光光谱（红色，TPF），插图是干燥的N-GQD样品的双光子荧光图像；（c）对不同厚度的生物组织仿体用N-GQD进行TPFI的示意图；（d）在不同深度处对组织仿体的TPFI和OPFI图[3，27]

最近的研究表明，一种简单的两步微波辅助方法，可用于制备具有优异荧光特性的腺嘌呤修饰的石墨烯量子点（A-GQD），如图4-4所示。得到的A-GQD的尺寸为3～5nm，显示出强烈的荧光，量子产率为21.63％，平均寿命为4.47ns。A-GQD呈现双光子绿色荧光，同时具有优异的生物相容性，使其适用于双光子荧光细胞成像，并且具有较高的对比度。除此之外，A-GQD还被证明具有高效的白光激活的抗菌特性[28]。基于其优异的光致发光性能、高生物相容性和抗菌等特性，A-GQD在生物医学中的应用越来越多。

图4-4　具有优异荧光特性的A-GQD[28]

（3）拉曼成像

与荧光不同，拉曼光谱利用来自分子振动激发模式的声子的非弹性散射[2]。拉曼成像提供了一个强大的分析工具，其具有较高的信噪比和可忽略的光漂白。通过将GO或rGO与金属纳米颗粒复合，可以制备具有较强的拉曼信号的拉曼成像探针，用于各种不同的生物医学应用。

GO的拉曼光谱具有固有的强D峰和G峰，并且可以通过复合金属纳米颗粒来进一步增强[29，30]。通过在GO上原位还原Ag+得到的Ag／GO复合物，其显示出显著的表面增强拉曼散射（SERS）效应[9]。叶酸结合的Ag／GO复合物也被开发出来，以用于叶酸受体阳性的癌细胞上的靶向SERS成像[29]。另外，通过在GO上原位还原AuCl－4可以得到Au／GO复合物，相对于添加原始GO培养的海拉细胞，添加了Au／GO复合物培养的海拉细胞显示出了更强的拉曼信号，得到了对比度更高的拉曼图像。Ma等制备了一种金纳米颗粒被紧密包裹在纳米GO（NGO）内的复合拉曼成像探针Au@NGO，其可应用于药物递送系统[31]，经测量，Au@NGO的D峰和G峰的强度比NGO高出一个数量级，这表明Au@NGO可以进行高灵敏度的拉曼成像。Liz-Marzán团队发展了一种种子介导的还原氧化石墨烯-金纳米星（rGO-Au NS）复合材料的生长方法，该复合材料可以用于抗肿瘤药物阿霉素DOX的加载，利用金纳米星的SERS效应，可以通过拉曼成像监控pH的改变，诱导DOX的释放，该复合材料提供了可以同时递送药物并能跟踪递送过程的平台[32]。除原位合成的方法外，Zhang研究团队还通过π-π堆积与其他分子相互作用，将经过预修饰的金纳米颗粒分别非共价地连接到GO和rGO片上，开发了Au／GO和Au／rGO复合材料[13，33]，实验证明了Au／GO复合材料是比金纳米颗粒更好的SERS基底。