细胞壁主要组分微区分布及木质素结构解析

4.3.1.1 细胞壁主要组分微区分布原位表征技术

（1）研究纤维素在木材各形态学区域的分布规律通常采用显微拉曼成像技术

纤维素在植物细胞壁中一般的分布规律为：木材细胞壁中，ML层不含纤维素，主要由半纤维素和木质素及一定量的果胶物质组成。P层中纤维素浓度低于S层。S层中微纤丝呈规律性排列，纤维素浓度较高，在S2层尤为明显。纤维素的含量从外层到内层逐渐增加，次生壁S2、S3层中纤维素含量较高。

张智衡^[11]采用拉曼显微技术对云南松纤维素分布的研究表明，S2层中纤维素分布比木质素分布更加均一。S2和S2-S3区域具有较高的纤维素浓度，而CC和CML纤维素浓度较低。而在草本植物中纤维素的分布特点则根据细胞类型的不同而存在较大差异。

Ma等^[12]对芒草节间组织进行了共聚焦激光拉曼光谱成像，结果显示厚壁纤维细胞S层纤维素浓度最高，其次是薄壁细胞和初生木质部导管，后生木质部导管中纤维素浓度最低。另外，植物细胞壁不同形态区域中纤维素微纤丝的排列取向也可通过多尺度显微成像技术得到观察。Agarwal等^[13]利用偏振光显微拉曼光谱仪研究了黑云杉细胞壁中纤维素分子的排列方向。结果表明纤维素分子中糖苷键C—O—C平行于细胞轴，而次甲基—CH垂直于细胞轴，形成分子间氢键的—OH平行于细胞轴。

（2）植物细壁中半纤维素分布的研究通常采用传统植物组织化学法、光谱显微镜法和免疫标记法

半纤维素化学结构相对复杂，区域化学分布不易研究，长期以来未引起学者们的重视。近年来人们发现半纤维素在细胞壁结构中的作用非常重要，不仅参与细胞壁纳米结构形成的调控，影响纤维素的聚合，还影响木质素聚合物的连接方式。因此，对半纤维素的研究越来越受到学者们的关注。与纤维素不同，半纤维素分布的研究比较困难，主要因为半纤维素是一种多糖，生物质的种类不同则其多糖种类不同，每种聚糖又由不同的糖基组成，结构非常复杂。另外，由于半纤维素的某些官能团与纤维素相似或者相同，导致半纤维素的某些化学信息容易被纤维素所掩盖。采用传统植物组织化学法研究云杉半纤维素的分布结果表明，CML和CC层中半纤维素浓度最高，其次是S1外层和S3层，S2层浓度最低。

近年来，特异性免疫荧光和免疫金标记技术也广泛用于研究聚木糖、聚甘露糖、聚半乳糖等在针叶木、阔叶木和部分禾本科植物细胞壁的分布规律，该法可以揭示半纤维素的分布特性并推测其在植物细胞壁结构中的作用。马静^[14]采用免疫标记技术研究了杨木半纤维素沉积规律，发现纤维S1层形成初期，聚木糖开始沉积，主要沉积在形成的S1层角隅处。随着杨木纤维S2层的形成，聚木糖在S1和S2层中的沉积量逐渐增多。在成熟的纤维细胞中，低取代度的聚木糖和高取代度的聚木糖显示了不同的沉积模式。低取代的聚木糖在外层的沉积比在内层的要多，而高取代度的聚木糖在纤维各亚层中的沉积量相对均一。在杨木纤维形成过程中，聚甘露糖主要沉积在纤维的次生壁中。

Donaldson等^[15]用免疫荧光标记技术阐述了放射松正常木和应压木中半纤维素的分布特点与木质化程度和微纤丝取向之间的关系，结果表明在木质化的细胞形态区域均有聚木糖和聚甘露糖的沉积，但在未木质化的薄壁细胞中则未检测到两种糖基的标记信号，在应压木高度木质化的次生壁外层半乳糖含量也会随之升高，但聚木糖和聚甘露糖含量则相对较少，通过共区域化研究发现在木材细胞壁的组装过程中，半纤维素多糖的分布和含量对细胞壁木质化程度和微纤维取向起调控作用。

（3）木质素分布的研究技术主要包括组织化学染色法、电子显微镜、紫外显微技术、拉曼显微技术及免疫标记技术等

Agarwal等^[16]采用HR800共聚焦拉曼光谱仪指出黑云杉细胞壁中木质素分布不均一，细胞角隅木质素浓度最高，其次是CML，S2层中木质素浓度最低。同样，利用拉曼显微镜技术通过积分1605cm^-1处木质素的特征峰得到的拉曼图像表明，黑杨细胞角隅（CC）木质素浓度最高，其次是复合胞间层（CML）和射线薄壁细胞次生壁（见图4-6）。对禾本科植物麦草木质素分布的研究发现，纤维细胞与非纤维细胞中CC层木质素浓度最高，S层中最低。在不同细胞类型中，薄壁细胞的木质素浓度最高，其次是纤维细胞，表皮细胞最低。此外，对羟基肉桂酸化合物在细胞壁中的分布规律进行研究，发现其主要存在于厚壁纤维细胞次生壁、薄壁细胞、后生木质部导管以及胞间层区域，在亚细胞水平对羟基肉桂酸与木质素存在明显伴生关系。木质素分子排列方向受细胞壁中碳水化合物基质的影响，在微细纤维无规排列的ML和P层中木质素结构接近球状，在微细纤维高度取向排列的S层中木质素结构较伸展。

正是这种复杂的生物结构与化学结构严重阻碍了木质纤维生物质的利用效率。因此，对木质纤维细胞壁结构复杂性的研究非常重要，解决了这一关键科学问题，才能从根本上找到木质纤维高值化利用的途径。

图4-6 木质素分布拉曼光谱成像图（1712～1519cm^-1）

（a）黑杨纤维细胞不同形态区域（b）黑杨射线薄壁细胞次生壁

F-S：纤维细胞次生壁 R-S：射线薄壁细胞次生壁

4.3.1.2 二次酶解木质素的分离及木质素细胞壁全溶表征技术

（1）二次酶解木质素的分离技术

目前，基于原本木质素分离和结构分析方面的研究结果，有研究人员为避免弱碱预润胀或弱酸处理对木质素中某些特定结构（酯键或醚键）造成破坏，以及以往中性溶剂抽提时木质素得率较低的弊端，提出了一种基于两次球磨和两次酶解的残渣木质素制备方法（见图4-7）^[17]，该木质素样品属于残渣木质素，既除去了碳水化合物对于研究某一材料原本木质素结构的影响，又能更好地代表该种材料中的全部木质素。该方法分离的木质素具有诸多优点，得率极高，代表性强，含糖量低，结构完整，在氘代试剂中溶解度好，是目前最为理想的结构分析之用的木质素样品。

总之，上述残渣木质素可以作为一种很有潜力的原本木质素分离方法应用到木质素结构的广泛研究中，该方法制备的木质素能够帮助全面鉴定植物细胞壁中的全部木质素的结构特征，同时该木质素能够作为“木质素参照物”促进开发更加有效的植物细胞壁解构和木质素解聚技术。也就是说，首先解决了典型的木质素样品制备问题。作为一种典型的原本木质素制备方法，该方法也可以广泛地用作研究转基因材料或者预处理前后木质纤维原料中的木质素的结构变化问题，为深入了解木质素的结构变化机理提供依据。

（2）木质素化学降解法表征技术

获得典型的木质素样品之后，就要采用各种表征方法对木质素实现结构分析。木质素结构分析方法大致可以分为两类：化学降解法和波谱法。化学降解法主要包括硝基苯氧化法、高锰酸钾氧化法、臭氧氧化法、酸水解法、硫醇酸解法和DFRC法（Derivatization Followed by Reductive Cleavage）等。波谱法包括各种光谱技术，主要有紫外吸收光谱（UV）、傅里叶红外吸收光谱（FT-IR）、拉曼光谱、核磁共振吸收光谱（¹H-NMR，¹³C-NMR，³¹P-NMR，2D-HSQC-NMR）等^[7]。

图4-7 二次酶解木质素的高效分离方法

①硝基苯氧化方法在木质素的研究中具有重要的意义，是研究木质素苯环结构的有效手段之一，该方法基于木质素中β-芳基醚键的断裂而形成芳环单体，进而反推木质素的组成（如S/G/H比例）。由于硝基苯氧化无法断裂木质素中的碳碳键，因此，该方法只能测定缩合部分木质素中的愈创木基丙烷、紫丁香基丙烷以及对羟基苯丙烷的比例。(www.xing528.com)

②高锰酸钾氧化法则对木质素侧链进行选择性的氧化，产物为芳香羧酸及其他脂肪族羧酸的混合物。通过分析降解产物，可以得到木质素苯环结构以及苯丙烷结构单元间的连接方式和出现的频率等信息，但是高锰酸钾氧化只能对样品进行定性分析。

③木质素的臭氧氧化分析法主要通过其降解产物的分析来确定木质素侧链的立体化学。臭氧解是将芳环氧化断裂，通过与模型物的比较，从而得到侧链赤型与苏型的比例，臭氧降解法主要是对木质素β-O-4连接型结构的立体结构。

④酸水解法是在含 0.2mol/L HCl的二氧六环-水溶液（9∶1，体积比）中回流得到了一系列木质素降解产物，以此确认了木质素中存在β-5和β-O-4连接。硫代酸解法为酸解法的改良方法，优点在于可以发生选择性较强的断裂反应，并能形成高得率且可以辨别的产物。但是硫代酸解法对实验室的条件要求较高，而且要用到有恶臭气味的乙烷硫醇，其局限性在于只能检测β-O-4键型连接的结构单元。

⑤衍生化还原降解（Derivatization followed by reductive cleavage，DFRC）可以选择性断裂芳基醚键，得到乙酰化的木质素单体，该方法没有硫醇酸解方法的恶臭味，是对硫醇酸解方法的改进。但这些化学方法在定量测定木质素结构时也受到了较大的限制，每个降解产物都需要合适的校正因子才可以实现定量，校正因子严格意义来讲需要用每一个降解产物的标准样做标准曲线校正，这无疑增加了操作难度，并且这些降解方法都只反映了非缩合木质素部分的结构特点，而对木质素的缩合部分结构判定仍存在问题。

近年来，裂解气相色谱/质谱（Pyrolysis-GC/MS）技术也开始在木质素的结构分析中起到辅助作用，它是在无氧条件下，样品快速气化并通过GC分离，然后被MS识别来确定木质素裂解单体结构，进而反推出木质素的S/G比例。这种方法对仪器的灵敏度要求较高，而且在不同条件下裂解的木质素产物有所不同，难于对木质素进行准确定量分析，只适合于木质素S/G比例的快速测定。

（3）木质素细胞壁全溶表征技术

在木质纤维原料预处理技术开发过程中，由于木质素是构成生物质原料“抗降解屏障”最为重要的因素，木质素的存在使得细胞壁三大组分难以有效解构和解离，进而影响生物质精炼总体效率。因此，研究生物质原料中木质素化学成分和结构特点既是破除生物质“抗降解屏障”的基础，又可为生物质原料中主要组分高效解构提供方法和技术支撑。木质素结构的定性和定量分析对于木质素材料和高附加值产品的开发至关重要。近年来，发展了细胞壁主要组分核磁全组分结构解析的方法，能够快速实现细胞壁组分中木质素和半纤维素的结构表征。一般地，在原位木质素核磁结构表征之前，球磨和氘代溶解体系非常重要。

理想地，如果球磨细胞壁能够溶解于氘代试剂，就能实现细胞壁组分的原位结构解析。实际上，细胞壁本身很难溶于任何单一溶剂，必须要进行处理或者选择合适的复配溶剂。此外，需要在核磁原位鉴定，还需要找到对应的氘代试剂。这两点要求限制着全溶体系的发展，也是全溶技术所要突破的技术障碍。随着核磁技术（高场核磁技术）和相应的细胞壁全溶体系的发现，使得细胞壁原位的核磁解析成为可能。科研人员找到了氘代二甲基亚砜/氘代吡（DMSO/Pyridine，4∶1，体积比），并将其应用到针叶材、阔叶材和草类原料玉米秸秆的木质素结构分析中^[18]。研究人员分别采用全溶体系和分离MWL对不同原料中的木质素进行结构分析。图4-8是采用全溶体系获得的几种典型生物质的全溶核磁图谱（侧链区信号）。

图4-8 细胞壁可溶物和木质素的二维碳氢相关谱脂肪族及侧链区

注：1ppm=1mg/kg。

（a）松木细胞壁（b）松木分离木质素（MWL）（c）山杨细胞壁（d）洋麻韧皮纤维（e）玉米秸秆细胞壁（f）玉米秸秆分离木质素（MWL）

图4-8 这个区域包括木质素典型连接键和碳水化合物（主要是半纤维素）的信号，虽然受到碳水化合物信号的影响，但是木质素的典型信号和碳水化合物信号基本没有重叠，因此可以通过此图谱快速鉴定木质素的典型连接键单元。同时也分离了相应木材的MWL进行对比，通过全溶体系和分离木质素的核磁图谱对比，发现全溶体系可以满足快速结构分析的要求，也说明了该体系在生物质木质素中的适用性较好。

图4-9 为细胞壁可溶物和木质素的二维碳氢相关谱芳香区图。

全溶体系最突出的优势是可以快速准确地获得生物质中木质素的S/G比例（除针叶材）。S/G比例对于阔叶材和草类生物质的利用（制浆，预处理和分离等）都很重要，因此快速获取生物质的S/G比例是其原本木质素研究的一个重要目的。从图4-9中可以发现，采用全溶体系核磁结构分析和分离木质素核磁分析所得的核磁图谱（芳环区域）几乎一致，说明了全溶体系在木质素基本成分快速鉴定中的应用。特别地，由于草类木质素中含有大量的羟基肉桂酸（阿魏酸和对香豆酸），并且阿魏酸和碳水化合物之间存在交联结构。因此，通过玉米秸秆的全溶体系可以观察到更多的阿魏酸酯结构图4-9（e），而在相应的玉米秸秆MWL就没有观察到更多的阿魏酸酯结构，这是由于在制备MWL中造成了阿魏酸和碳水化合物之间酯键连接键的破坏。

此外，Mansfield等人还提出了大批量原位核磁分析的实验流程^[19]。该方法历经生物质原料的前期脱脂，酶处理（淀粉酶，蛋白酶），充分球磨，溶解（氘代DMSO/Pyridine，4∶1，体积比），和超声等步骤制备适合核磁共振检测的样品。通过该方法能够快速地测定出不同植物的木质素的成分和S/G比例（图4-10）。比如，发现杨木的S/G比例是1.64，也发现了杨木中特有的对羟基苯甲酯，而松木中仅含有愈创木基单元和少量的对羟基苯基单元。相比之下，玉米秸秆中含有紫丁香基单元，愈创木基单元和少量的对羟基苯基单元。同时，通过该方法，植物中的羟基肉桂酸含量也能一起计算出，这给生物质能源的原料筛选提供了技术保障。

应注意，木质素细胞壁全溶表征技术在获得木质素结构信息时，大量的糖类信号和木质素信号重叠，导致难以对木质纤维原料中全部木质素信号进行识别。也就是说，全溶体系对木质素进行结构分析时仅仅能得到木质素的S/G比例等基础信息。总之，植物细胞壁中木质素大分子结构的解译既需要木质素的高效分离方法，也需要强大有效的解析技术^[7]。

图4-9 细胞壁可溶物和木质素的二维碳氢相关谱芳香区

注：1ppm=1mg/kg。

（a）松木细胞壁（b）松木分离木质素（MWL）（c）山杨细胞壁（d）洋麻韧皮纤维细胞壁（e）玉米秸秆细胞壁（f）玉米秸秆分离木质素（MWL）

图4-10 不同植物的木质素的成分和S/G比例

（a）杨木（b）松木（c）玉米秸秆（d）拟南芥

注：1ppm=1mg/kg。