解密细胞壁微观结构及木质素化学结构

（1）生物质细胞壁微观结构

生物质精炼之前，深入解析植物细胞壁微观结构对于后续生物质精炼过程极其重要。植物细胞壁的微观结构主要讨论细胞壁的层状结构及其主要化学成分在细胞壁中的分布与细胞间的关系。

①研究生物质细胞壁微观结构的基本方法手段。显微（光学显微镜、扫描电子显微镜、透射电子显微镜等）及显微光谱技术（显微红外光谱、显微拉曼光谱、共聚焦荧光显微光谱以及紫外显微光谱等）能够在细胞及亚细胞水平原位状态提供生物质细胞壁微观结构及组分分布信息。扫描电子显微镜和透射电子显微镜可以直观地表现细胞壁表面及内部结构。相对于显微红外光谱需要排除水分干扰及显微紫外光谱只能分析单因素变化，显微拉曼光谱具有较大的优势，不仅制样简单而且无须染色、包埋等，能无损、快速、可重复地对样品进行定性、定量及结构分析，分辨率较高，对于研究木质纤维生物质细胞壁组分在细胞壁中的分布十分重要，而且可以提供制浆造纸过程中脱木质素动力学理论相关信息。综合利用各种显微技术，能够弥补应用单一技术引起的缺陷，更深入地理解生物质精炼过程中木质纤维素生物质微观结构的变化以及反应机理。

②生物质显微构造特征。借助于普通光学显微镜观察到的特征，即显微构造特征。不同种类的生物质显微构造存在很大差异，细胞壁中除了主要的纤维细胞之外还存在其他的杂细胞。各种细胞呈现复杂的形态结构。在针叶材中，其组成的主要细胞类型较为单一，细胞排列也比较规整有序；管胞是最主要的纤维细胞，无导管组织，但含有少量薄壁细胞。阔叶材的内部构造则更加复杂，细胞类型繁多且排列不规整，主要包含导管分子、纤维细胞、射线薄壁细胞和轴向薄壁细胞等多种细胞类型；其中木纤维是阔叶材最主要的纤维细胞。禾本科植物由表皮组织、基本薄壁组织、维管组织和机械组织构成。禾本科植物的维管束细胞组成较为复杂，主要包含厚壁纤维细胞、初生木质部导管、后生木质部导管、筛管和伴胞。

③生物质超微构造特征。应用电子显微技术（如：扫描电子显微镜、透射电子显微镜）观察到的植物细胞壁特征称为超微构造特征。木质纤维生物质超微结构主要包括细胞壁中微纤丝的空间取向以及细胞壁的分层结构。纤维素是构成细胞壁的骨架物质，内含其他物质。在电子显微镜下看到，这种骨架由一层层纤维素微纤丝组成，每一层微纤丝基本上是平行排列，每添加一层，微纤丝排列的方位不同，层与层之间微纤丝的排列交错成网。微纤丝之间的空间通常被半纤维素填充。而木质素是结壳物质，将纤维素与半纤维素黏结在一起，形成类似钢筋混凝土式坚实的细胞壁结构。除细胞组成类型不同之外，细胞壁的分层结构也根据细胞壁的分化形成、化学成分和组分沉积等方面的差异而具有特异性。一般而言，植物细胞壁由外到内分为胞间层、初生壁和次生壁三个部分（见图4-3）^[4]。胞间层又被称为中间层（middle lamella，简称ML层），是细胞分裂产生新细胞时相邻两个子细胞之间形成的一层薄膜，在成熟的植物细胞壁ML层高度木质化起粘连和缓冲作用。初生壁（primary wall，简称P层），形成于植物细胞生长初期，是由原生质体分泌物在ML层内侧形成的非木质化薄层，因为富含果胶具有柔软性和可塑性，从而满足了细胞体积增长的需要。在成熟的植物细胞壁中，P层主要由纤维素、半纤维素和果胶质等多糖组成，由于壁层较薄，通常会与ML层粘连在一起，因此在进行超微结构分析时，将初生壁和中间层统称为复合胞间层（compound middle lamella，简称CML层）。次生壁（secondary wall，S层），是植物体内一部分细胞停止生长以后，其原生质体继续分泌纤维素等物质沉积在初生壁上形成的壁层，主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。在次生壁形成的过程中，细胞壁的厚度逐渐增加，最终占细胞壁厚度的95%以上。在细胞壁增厚的同时伴随着木质化，直至细胞原生质体消失，细胞腔变成中空，细胞成为死细胞。在木本植物体内存在大量的具有次生壁的木质化细胞，这些具有次生壁的死细胞在植物体内不仅起输送水分和溶解于水中的无机盐的作用，而且起机械支撑作用。根据由纤维素分子链组成的微纤丝排列方向不同，可进一步将次生壁由外向里分为三层，即次生壁外层（S1层）、次生壁中层（S2层）和次生壁内层（S3层）。S1层与P层的内侧毗邻，一般占细胞壁厚度的10%～20%，微纤丝呈左右螺旋交叉排列，其与纤维轴的夹角一般为50°～70°；S2层占细胞壁厚度的70%～90%，微纤丝呈单向螺旋排列，其与纤维轴的夹角一般为10°～20°；S3层仅占细胞壁厚度的2%～8%，微纤丝也呈单向螺旋排列，但其与纤维轴的夹角较大，一般为60°～90°，甚至有些几乎与轴向垂直。此外，在3个以上细胞之间存在1个共有的区域—细胞角隅（cell corner，即CC）。

应注意到细胞壁微观结构是植物行为学研究的主要领域，是制浆造纸工艺学中重要的基础研究之一。对这一科学难题的深入研究将有助于建立生物质组分的清洁高效解离体系，使之成为生物质组分分离的基础。此外，对细胞壁超微结构的研究将不断为生物质转化利用提供新的视野。

（2）生物质细胞壁三大组分间连接键

①生物质细胞壁三大组分自身间连接键。除了复杂的细胞壁微观化学结构，木质纤维细胞壁化学组分结构也非常复杂，主要包括纤维素、木质素和半纤维素，其中纤维素是由β-D-葡萄糖基通过β-1，4糖苷键连接而成的线性高分子均聚物，这些线性的纤维素链上的羟基基团通过分子内或分子间氢键作用形成了纤维素片层结构，使得纤维素在自然界中以高度结晶的纤维形式存在。半纤维素是一类非均一多糖的总称，常带有短的侧链，是多分枝的低分子聚合物。依据植物纤维原料的种类、地理位置、取材部位、处方法的不同，半纤维素结构也各不相同。针叶木中半纤维素主要为半乳糖葡萄糖甘露聚糖和阿拉伯糖半乳聚糖，阔叶木中半纤维素主要为葡萄糖醛酸木聚糖和葡萄糖甘露聚糖，禾本科植物中半纤维素主要为阿拉伯木聚糖和阿拉伯醛酸木聚糖。木质素是由苯丙烷结构单元通过醚键和碳-碳键连接而成的芳香族高分子化合物，通常认为木质素和半纤维素之间有着化学键连接，而纤维素与木质素和半纤维素之间虽没有化学键连接，但存在着强大的氢键、弱键、范德华力等作用力。由于纤维素、半纤维素和木质素自身的聚集态结构、晶体特性以及键合机制十分复杂，迄今为止，科学界对其认识还远远不够。

图4-3 植物细胞壁超微结构模型

②木质素-碳水化合物之间连接键。目前认为，半纤维素与纤维素细小纤维以氢键连接，而不存在半纤维素与纤维素之间的共价键连接。木质素与半纤维素之间通过苄基醚键、苯基糖苷键、酯键等化学键连接，人们通常称为木质素-碳水化合物复合体（Lignin Carbohydrate Complex），简称LCC^[5-6]。在木化组织中，半纤维素常通过葡萄糖醛酸侧链的羧基（C6）与木质素以酯键连接。与木本科植物细胞壁相比，禾本科植物细胞壁中木质素的连接更为复杂。禾本科植物细胞壁中，阿拉伯糖基和木糖基也通过酯键或芳基-醚键与木质素连接。此外，禾本科植物细胞壁中还含有一定量的羟基肉桂酸，即对香豆酸、阿魏酸和芥子酸。其中阿魏酸能够以酯键与半纤维素连接，同时还以醚键与木质素连接，形成“半纤维素-酯-阿魏酸-醚-木质素”的桥式结构。而对香豆酸则能够以酯键与木质素的侧链的γ位连接，形成“对香豆酸-酯-木质素”结构。

通过多年研究，人们已经证实木质素不是简单地沉积在细胞壁聚糖之间，在亲水性聚糖和疏水性木质素之间也存在相互作用。大量研究显示，在木材和纸浆中都存在木质素和碳水化合物形成的共价键。目前来讲，主要的LCC键分别为苄基醚键、苯基糖苷键、γ酯键等主要键型，如图4-4所示。

图4-4 木质素主要基本连接单元及木质素-碳水化合物连接键复合体

A：β-O-4′ B：β-β′ C：β-5′ D：β-1′R=C6（葡萄糖，甘露糖，半乳糖）；C5（阿拉伯糖） PhGlC—苯基糖苷键 Est—γ-酯键 BE—卡基醚键

a.苄基醚键。Brownell通过实验表明，黑云杉木材中的木质素C_α位与半纤维素羟基所形成的连接键在100℃以下，对1%氢氧化钠溶液是稳定的，超过100℃则开始断裂；在碱性介质中这一键型比葡萄糖苷键更为稳定，说明此键比较牢固；这种连接键对硼氢化钠处理是稳定的，而硼氢化钠会使半缩醛键断裂，说明该连接键不是半缩醛键。此外，苄基醚键对酸敏感，在极弱的酸或二氧六环-水（1∶1）中加热到180℃就会断裂。苄基醚键存在于木质素苄基醇羟基与半纤维素的游离羟基之间，木质素在生物合成过程中也有这种键的存在。葡萄糖基第6个“C′”上的羟基与木质素结构单元的侧链碳原子之间可构成醚键结合。此外，半纤维素的半乳糖基上C′6的羟基或阿拉伯糖基C′5上的羟基同样可以与木质素结构单元构成醚键。(www.xing528.com)

b.苯基糖苷键。苯基糖苷键是由木质素结构单元的酚羟基与碳水化合物上的苷羟基之间形成的连接键。植物纤维原料在木质化过程中，苯基配糖物存在的可能性不大，但沉积的木质素在适当酶的作用下就可能出现，从而形成此种键型。这种结合在弱酸性以及高温中性水中就易受到水解而断裂。

c.γ酯键。半纤维素中的4-O-甲基-葡萄糖醛酸的羧基与木质素结构单元侧链上的羟基形成酯键结合。由于阔叶木和非木材植物半纤维素含较多的4-O-甲基-葡萄糖醛酸，所以在这些植物的LCC中，有较多的糖醛酸酯键连接，如果半纤维素中的4-O-甲基-葡萄糖醛酸基已与木糖基形成酯键连接，则与木质素之间就不会形成酯键，只能形成醚键连接。此外，半纤维素的木糖基的C2或C3上的羟基与木质素侧链γ位置的OH形成酯键；一般来讲，这种酯键结合对碱非常敏感，即便是温和的碱处理也很容易被水解。

（3）木质素高效分离及结构解析

除了LCC复合体结构的研究，深入理解植物纤维原料中的木质素原始结构对于理解生物质原料中木质素结构也非常重要，研究者一般通过分离原本木质素用于植物原料中的木质素结构分析和研究。一般地，用于结构表征的木质素，按照分离原理大致分为两大类。一类为溶解类木质素，即采用有机溶剂（如1，4-二氧六环）从球磨的生物质原料中溶解出木质素，经纯化后用于结构表征，目前用于结构分析的木质素大多数属于这类木质素。另一类为残渣木质素，即采用酶水解（纤维素酶和半纤维素酶）方法去除绝大部分碳水化合物，而保留生物质原料中残渣木质素。但由于残渣木质素样品中仍含有少量未水解碳水化合物，从而导致其溶解度较差，进而影响木质素的结构分析^[7]。

一般情况下分离过程中结构变化小，得率高，代表性强的木质素样品更适用于木质素的结构分析。通常采用96%的1，4-二氧六环抽提球磨的生物质原料，经分离纯化后得到木质素样品进行结构分析。1956年研究人员提出了磨木木质素（MWL）的制备方法。该方法一直被研究人员用来分离原本木质素并用于植物细胞壁中木质素的结构表征。但由于传统的MWL得率相对较低，且其得率与球磨方式和时间密切相关，因此需要对该方法进行改进。研究人员采用纤维素酶处理球磨木粉除去大部分碳水化合物，酶解后的残渣再用96%的1，4-二氧六环提取得到纤维素酶解木质素（CEL）。研究结果显示，在结构上CEL与MWL较为相似，但CEL得率明显高于MWL，因此CEL较MWL更能代表原本木质素。

然而，纤维素的高结晶结构和不可及性较大地影响了酶水解效率，从而导致酶水解残渣中仍有部分不能水解的碳水化合物。为克服该困难，酶解前的预润胀处理引起研究人员的广泛关注，如采用有机溶剂（二甲基亚砜/N-甲基咪唑等）先预润胀或溶解球磨后的木粉，再逐滴加入水或乙酸乙酯中再生，随后用纤维素复合酶处理再生后的残渣。预润胀可降低纤维素结晶度，在一定程度上提高再生细胞壁的酶解效率，增加酶水解木质素的得率，但此方法在前期预润胀过程中会损失少量木质素片段。

2003年，根据苯基糖苷键、酯键、苄基醚键等LCC连接键可在弱酸条件下部分断裂，研究人员提出了一种新木质分离方法。该方法采用0.01mol/L盐酸和85%的二氧六环水溶液对酶水解残渣进行加温提取（86 ℃），制备得到的木质素被命名为酶解-温和酸解木质素（EMAL）。经对比研究发现，利用温和酸解分离得到的木质素较传统的MWL和CEL得率高，纯度高，且在EMAL提取过程中少量木质素与碳水化合物复合体的连接键发生了断裂，而木质素大分子内的各主要连接键并无明显断裂。

上述方法一般适于木材类生物质，而草类原料中由于存在羟基肉桂酸交联结构，导致该方法所得木质素得率和纯度相对较低。在草类原料中，对香豆酸一般以酯键连接在木质素侧链的位置，而阿魏酸分别和半纤维素与木质素以酯键和醚键相连，形成交联的桥式结构。针对这些特殊的交联结构，研究人员提出了不同梯度条件下的温和碱处理草类原料，并对得到的不同木质素组分结构进行表征。该方法利用碱处理断裂木质素与碳水化合物之间对碱敏感的连接键，使大部分木质素与碳水化合物分离，然后通过溶解和沉淀方式分离木质素组分。上述方法均涉及溶剂提取和木质素的酸析沉淀分离。

2015年，研究人员以桉木为原料，提出了基于室温弱碱处理结合原位酶解的“全木质素”的制备方法，得到以残渣形式保留下来的弱碱润胀酶解残渣木质素（SREL），并对该残渣木质素进行全面的结构研究。相比较而言，用于提取CEL的酶水解残渣由于未能预润胀而导致酶水解效率有限，最终使得残渣木质素在氘代试剂中的溶解度较差而无法进行后续分析。研究发现，SREL的得率（95%）明显高于同等条件下的碱木质素（AL，12%）和纤维素酶解木质素（CEL，20%），且SREL含糖量（8.7%）相比同等条件下的CEL（13.4%）低。通过元素分析、凝胶渗透色谱（GPC）、二维碳氢相关核磁共振谱、磷谱和分析热解技术对上述木质素进行全面表征，同时定量比较这些木质素中的主要连接键。核磁结果显示，SREL与相应CEL比较，紫丁香基含量高，且含有大量的 β-O-4连接，酚羟基含量少，与传统的酶木质素CEL、碱木质素AL的化学组成和结构相似。

截至目前，原始木质素结构领域的相关研究仍在进行，后续还需要在以下方面进行探索：

①木质素结构研究的一大障碍是高效分离与纯化。由于生物质细胞壁结构的复杂性，使得木质素很难以“结构完全不变的形式”分离出来。并且，天然木质素含有酚羟基等活性基团，在条件剧烈的分离过程中，容易发生氧化和缩合反应。因此，在结构研究所用的木质素样品的分离中，应尽量避免破坏木质素的原本结构，采用中性溶剂（二氧六环水溶液）以较高的得率提取出植物细胞壁中的木质素。此外，采用高效酶解的方法将木质素作为残渣留下也是原本木质素分离的可靠手段。对于特定原料原本木质素结构的分析研究有助于该原料新型解构方法的开发，将为该生物质原料的清洁高效分离和利用提供直接依据。

②木质素精确结构测定方法的开发。现代各种测试仪器（如光谱、色谱、质谱、NMR等）在木质素结构研究中发挥了重要作用，推动了木质素研究的进步。仪器分析手段方便快捷，但大都不能准确地进行定量分析，难以做出精确判断。木质素研究的一些经典化学方法虽精确，但存在转化率低，代表性差等缺点。随着分析仪器和分析技术的进步，研发新的更为精确的木质素分析方法势在必行，基于高分辨率核磁共振技术的定性和定量木质素结构测定方法，将对木质素资源的开发利用做出重要贡献；此外，基于全溶体系和高场核磁二维碳氢相关技术，可以实现对细胞壁主要组分结构的快速鉴定，该方法相比分离木质素来讲，得到的木质素连接键信息容易受到碳水化合物的影响，但是该方法的优势是：a.可快速实现原料中木质素S/G值的测定；b.可比较研究不同预处理过程中木质素的结构变化机理。

总之，木质纤维原料细胞壁微观结构和木质素化学结构解译是组分分离和组分转化的基础，对这一科学问题的深入研究有助于建立生物质组分的清洁高效分离体系。