大肠菌群是一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
任务目标
（1）知道样品处理的方法。
（2）学会大肠菌群的检测方法。
（3）能检测肉制品的大肠菌群数。
知识准备
大肠菌群MPN计数法
（参照GB 4789.3—2010
《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》，部分有改动）
1 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
1.1 恒温培养箱：36℃±1℃。
1.2 冰箱：2～5℃。
1.3 恒温水浴箱：46℃±1℃。
1.4 天平：感量0.1g。
1.5 均质器。
1.6 振荡器。
1.7 无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。
1.8 无菌锥形瓶：容量500mL。
1.9 无菌培养皿：直径90mm。
1.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
1.11 菌落计数器。
2 培养基和试剂
2.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤
2.1.1 成分：胰蛋白胨或胰酪胨20.0g；氯化钠5.0g；乳糖5.0g；磷酸氢二钾（K2HPO4）2.75g；磷酸二氢钾（KH2PO4）2.75g；月桂基硫酸钠0.1g；蒸馏水1000mL。
2.1.2 制法：将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH至6.8±0.2，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。
2.2 煌绿乳糖胆盐（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉汤
2.2.1 成分：蛋白胨10.0g；乳糖10.0g；牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液200mL；0.1%煌绿水溶液13.3mL；蒸馏水800mL。
2.2.2 制法：将蛋白胨、乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200mL（将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，调节pH至7.0～7.5），用蒸馏水稀释到975mL，调节pH，再加入0.1%煌绿水溶液13.3mL，用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。
2.3 磷酸盐缓冲液
2.3.1 成分：磷酸二氢钾（KH2PO4）34.0g；蒸馏水500mL。
2.3.2 制法：
贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH7.2，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。
稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15min。
2.4 无菌生理盐水(www.xing528.com)
2.4.1 成分：氯化钠8.5g，蒸馏水1000mL。
2.4.2 制法：称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。
2.5 无菌1mol/L的NaOH
2.5.1 成分：NaOH40.0g；蒸馏水1000mL。
2.5.2 制法：称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。
2.6 无菌1mol/L的HCl
2.6.1 成分：浓盐酸90mL；蒸馏水1000mL。
2.6.2 制法：移取浓盐酸90mL，用蒸馏水稀释至1000mL，121℃高压灭菌15min。
3 检验步骤
3.1 样品的稀释与接种
称取25g固体样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min，制成1：10的样品匀液。样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调节。用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。
3.2 初发酵试验
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。
3.3 复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。
3.4 大肠菌群最可能数（MPN）的报告
按3.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见下表），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。
大肠菌群最可能数（MPN）检索表
注：1.本表采用3个稀释度[0.1g（mL）、0.01g（mL）和0.001g（mL）]，每个稀释度接种3管。
2.表内所列检样量如改用1g（mL）、0.1g（mL）和0.01g（mL）时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01g（mL）、0.001g（mL）0.0001g（mL）时，则表内数字应相应提高10倍，其余类推。
任务实施
一、配制实验试剂，填写试剂单
二、准备实验仪器和设备，填写仪器和设备单
三、写出样品处理方法和步骤
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四、写出样品测定方法和步骤
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五、数据记录及计算
任务评价
考考你
1.测定大肠菌群有什么意义？
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2.大肠杆菌等同于大肠菌群吗？如果不是，请解释它们之间的关系。你知道大肠菌群中有哪些是致病的？请列出3个。
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