菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。菌落总数可用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣，也在一定程度上影响着食品保质期的长短。
任务目标
（1）知道样品处理的方法。
（2）学会菌落总数的检测方法，能检测肉制品的菌落总数。
（3）会计算并报告菌落总数。
知识准备
菌落总数的测定
（参照GB 4789.2—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》）
1 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
1.1 恒温培养箱：36℃±1℃，30℃±1℃。
1.2 冰箱：2～5℃。
1.3 恒温水浴箱：46℃±1℃。
1.4 天平：感量为0.1g。
1.5 均质器。
1.6 振荡器。
1.7 无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。
1.8 无菌锥形瓶：容量250mL、500mL。
1.9 无菌培养皿：直径90mm。
1.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
1.11 放大镜或/和菌落计数器。
2 培养基和试剂
2.1 平板计数琼脂培养基
2.1.1 成分：胰蛋白胨5.0g；酵母浸膏2.5g；葡萄糖1.0g；琼脂15.0g；蒸馏水1000mL。
2.1.2 制法：将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH至7.0±0.2。分装锥形瓶，121℃高压灭菌15min。
2.2 磷酸盐缓冲液
2.2.1 成分：磷酸二氢钾（KH2PO4）34.0g；蒸馏水500mL。
2.2.2 制法：
贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。
稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于锥形瓶及试管中，121℃高压灭菌15min。
2.3 无菌生理盐水
2.3.1 成分：氯化钠8.5g，蒸馏水1000mL。
2.3.2 制法：称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。
2.4 75%消毒酒精
3 检验步骤
3.1 样品的稀释
称取25g固体样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min，制成1：10的样品匀液。用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。按上述操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。根据对样品污染状况的估计，选择2～3个适宜稀释度的样品匀液，在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。及时将15～20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
3.2 培养
待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h。如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL），凝固后翻转平板，36℃±1℃培养48h±2h。
4 菌落计数
可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits，CFU）表示。
4.1 选取菌落数在30～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。(https://www.xing528.com)
4.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
4.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
5 结果与报告
5.1 菌落总数的计算方法
5.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g样品中菌落总数结果。
5.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按下式计算：
式中 N——样品中菌落数；
ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；
n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；
n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；
d——稀释因子（第一稀释度）。
示例：
上述数据按5.2.2数字修约后，表示为25000或2.5×104。
5.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
5.1.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
5.1.5 若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
5.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
5.2 菌落总数的报告
5.2.1 菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。
5.2.2 菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。
5.2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。
5.2.4 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
5.2.5 称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。
任务实施
一、配制实验试剂，填写试剂单
二、准备实验仪器和设备，填写仪器和设备单
（续）
三、写出样品处理方法和步骤
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四、写出样品测定方法和步骤
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五、数据记录及计算
任务评价
考考你
1.测定菌落总数有什么意义？
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2.菌落总数可能会出现菌落蔓延，你有办法防止吗？
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3.如果有样品的细屑被吸到培养皿中可能会被误认为是菌落，你能找到较好的办法解决吗？
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