蛋白质是食品中重要的营养指标之一。不同的食品中蛋白质的含量各不相同，一般来说，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品，测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有重要意义。
任务目标
（1）明白蛋白质含量测定的原理。
（2）学会蛋白质含量测定的方法，能测定肉制品中的蛋白质含量。
知识准备
凯式定氮法
（参照GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》）
1 原理
食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。
2 试剂
除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水。
2.1 硫酸铜（CuSO4·5H2O）。
2.2 硫酸钾（K2SO4）。
2.3 硫酸（H2SO4密度为1.84g/L）。
2.4 硼酸（H3BO3）。
2.5 甲基红指示剂（C15H15N3O2）。
2.6 溴甲酚绿指示剂（C21H14Br4O5S）。
2.7 亚甲基蓝指示剂（C16H18ClN3S·3H2O）。
2.8 氢氧化钠（NaOH）。
2.9 95%乙醇（C2H5OH）。
2.10 硼酸溶液（20g/L）：称取20g硼酸，加水溶解后并稀释至1000mL。
2.11 氢氧化钠溶液（400g/L）：称取40g氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至100mL。
2.12 硫酸标准滴定溶液（0.0500mol/L）或盐酸标准滴定溶液（0.0500mol/L）。
2.13 甲基红乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g甲基红，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL。
2.14 亚甲基蓝乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g亚甲基蓝，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL。
2.15 溴甲酚绿乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g溴甲酚绿，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL。
2.16 混合指示液：2份甲基红乙醇溶液（2.13）与1份亚甲基蓝乙醇溶液（2.14）临用时混合。也可用1份甲基红乙醇溶液（2.13）与5份溴甲酚绿乙醇溶液（2.15）临用时混合。
3 仪器和设备
3.1 天平：感量为1mg。
3.2 定氮蒸馏装置：如下图所示。
3.3 自动凯氏定氮仪。
4 分析步骤
4.1 凯氏定氮法
4.1.1 试样处理：称取充分混匀的固体试样0.2～2g、半固体试样2～5g或液体试样10～25g（约相当于30～40mg氮），精确至0.001g，移入干燥的100mL、250mL或500mL定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜（2.1）、6g硫酸钾（2.2）及20mL硫酸（2.3），轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热0.5～1h。取下放冷，小心加入20mL水。放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。
定氮蒸馏装置图
1-电炉；2-水蒸气发生器（2L烧瓶）；3-螺旋夹；4-小玻杯及棒状玻塞；5-反应室；6-反应室外层；7-橡皮管及螺旋夹；8-冷凝管；9-蒸馏液接收瓶。
4.1.2 测定：按图装好定氮蒸馏装置，向水蒸气发生器内装水至2/3处，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇溶液（2.13）数滴及数毫升硫酸（2.3），以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾。
4.1.3 向接收瓶内加入10.0mL硼酸溶液（2.10）及1～2滴混合指示液（2.16），并使冷凝管的下端插入液面下，根据试样中氮含量，准确吸取2.0～10.0mL试样处理液由小玻杯注入反应室，以10mL水洗涤小玻杯并使之流入反应室内，随后塞紧棒状玻塞。将10.0mL氢氧化钠溶液（2.11）倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸馏10min后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。以硫酸或盐酸标准滴定溶液（2.12）滴定至终点，其中2份甲基红乙醇溶液（2.13）与1份亚甲基蓝乙醇溶液（2.14）指示剂，颜色由紫红色变成灰色，pH5.4；1份甲基红乙醇溶液（2.13）与5份溴甲酚绿乙醇溶液（2.15）指示剂，颜色由酒红色变成绿色，pH5.1。同时作试剂空白。
4.2 自动凯氏定氮仪法
称取固体试样0.2～2g、半固体试样2～5g或液体试样10～25g（约相当于30～40mg氮），精确至0.001g。按照仪器说明书的要求进行检测。
5 结果计算(www.xing528.com)
试样中蛋白质含量的计算公式为
式中 X——试样中蛋白质的含量（g/100g）；
V1——试液消耗盐酸标准滴定液的体积（mL）；
V2——试剂空白消耗盐酸标准滴定液的体积（mL）；
V3——吸取消化液的体积（mL）；
c——盐酸标准滴定溶液浓度（mol/L）；
0.0140——1.0mL盐酸[c（HCl）=1.000mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量（g）；
m——试样的质量（g）；
F——氮换算为蛋白质的系数。肉与肉制品为6.25。
以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，蛋白质含量≥1g/100g时，结果保留三位有效数字；蛋白质含量<1g/100g时，结果保留两位有效数字。
6 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
任务实施
一、配制和标定实验试剂，填写试剂单
二、准备实验仪器和设备，填写仪器和设备单
（续）
三、写出样品处理方法和步骤
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四、写出样品测定方法和步骤
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五、数据记录及计算
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（续）
任务评价
考考你
1.简述凯氏定氮法测定蛋白质过程中，每一步颜色的变化。
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2.样品经消化进行蒸馏前，为什么要加入NaOH？加入NaOH后溶液发生什么变化？
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为什么？如果没有变化，说明什么问题？须采用什么措施？
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3.凯氏定氮过程中，怎样防止氨的损失？（至少6点）
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4.蛋白质消化后，转移定容时应该如何操作？为什么？
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5.蛋白质测定时，蒸馏完毕应该如何操作？为什么？
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6.用凯式定氮法测定蛋白质时，如果测定结果偏低，可能影响的因素主要有哪些？
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