氧化石墨烯水培对植物生长的影响

在水培条件下，GO往往表现出高植物毒性。很多研究从植物自身入手，通过分析植物器官结构变化、体内酶活性变化及基因表达变化等来揭示GO对植物所产生的毒性。

Jiao等采用GO溶液水培烟草，研究了GO对烟草根长的影响，实验结果如图4-2所示。20mg/L的GO对根伸长表现出很强的抑制作用，与空白组相比，GO处理增加了烟草不定根的数量，最终导致GO培养的烟草根总重为空白组的1.5倍。GO对烟草根长的影响主要来源于其对植物生长素吲哚乙酸（Indole-3-acetic Acid,IAA）基因转录水平的影响。GO的处理会加速与IAA的合成相关的三种基因（IAA3、IAA4和IAA7）的转录。GO的加入同时加速了生长素响应因子ARF（ARF2和ARF8）的转录。IAA3、IAA4、IAA7的增加会抑制IAA的合成，从而抑制根的伸长，而ARF的大量转录则会增加不定根的数量。进一步研究结果表明，GO水培处理会提高烟草中的过氧化物酶（Peroxidase,POD）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）和过氧化氢酶（Catalase,CAT）的活性。这些酶活性的提高说明活性氧簇（Reactive Oxygen Species,ROS）积累水平的提高，即GO引发了烟草体内的氧化应激反应。

图4-2　20mg/L的GO对烟草根长的影响

Begum等研究了GO对卷心菜、番茄、苋菜及生菜幼苗生长的影响，检测了植物根茎的生物量、细胞死亡水平及ROS水平。将尺寸为微米级的单层GO溶解于水中，配制一系列浓度的GO。种子萌发期，仅用GO水溶液处理植物种子，而后将幼芽转移至含有不同浓度GO的霍格兰营养液中处理。植物萌发结果如图4-3所示，番茄、卷心菜和苋菜的子叶和根系的生长均受到明显抑制，且GO浓度越高，抑制作用越强。培养20d后，对番茄、卷心菜和苋菜的根长、茎长及生物量进行测试，结果表明，GO显著抑制了植物的生长，抑制程度依赖于GO浓度及培养时间。2000mg/L GO处理的植物根极短且根毛几乎消失。这是因为植物根尖和根毛会分泌黏液，进而对GO产生一定的吸附作用。经过一段时间的水培，可以明显看到植物根部变黑。根部大量富集的GO会对植物产生毒性。植物的叶片的生长也因GO的处理而受到抑制。而与番茄、卷心菜和苋菜相比，生菜的生长并未受到GO的影响。原因在于生菜的根部结构与其他三种植物不同。番茄、卷心菜和苋菜的根为直根系，有明显的主根，而生菜的根为须根系，根部有大量的根须。同时植物之间不同的木质部结构决定了其分别具有不同的水传输速率，而且其对纳米材料的吸收过程也不同。可见，不同种类的植物对GO的响应并不相同。

图4-3　GO对子叶和根系的影响

（a）～（c）分别为番茄、卷心菜和苋菜种子在有GO溶液的滤纸上和无GO溶液的滤纸上孕育4d的结果

GO在植物根部的大量积累会诱发植物产生过量的ROS。H2O2是细胞发生氧化应激过程中的一个中间产物，H2O2的存在对应着ROS的积累。用2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）荧光探针染色法测试叶片的ROS积累水平，该方法可使得叶片中的H2O2可视化。对比空白组和浓度为1000mg/L的GO溶液处理的植物，结果如图4-4所示，GO显著提高了叶片中ROS的积累量。用3，3′-二氨基联苯胺（DAB）染色法进一步验证ROS的积累水平。H2O2与过氧化物酶反应，分解为水和氧。释放的氧进一步氧化DAB，产生黄褐色沉淀，沉淀处即为H2O2位点。如图4-4所示，两个图中的（a）（b）、（c）（d）、（e）（f）分别为卷心菜、番茄、菠菜叶片的检测结果，1000mg/L GO处理的植物叶片呈现出大量明显的深黄色沉淀。

图4-4　利用2 ′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）荧光探针染色法测试GO对叶片中ROS积累的影响

两个图中左列的（a）（c）和（e）分别为无GO培育的卷心菜、番茄和菠菜叶片；右列的（b）（d）和（f）分别为1000mg/L GO培育的卷心菜、番茄和菠菜叶片。绿色的信号表示ROS产生的位点

GO对植物的毒性还表现为对细胞膜的破坏和提升细胞死亡率。利用伊文思蓝染色法和电导率法对细胞膜结构和细胞死亡率进行检测。伊文思蓝染色法的原理为活细胞的细胞结构正常，细胞膜具有良好的完整性，伊文思蓝会被阻拦在细胞外；死亡细胞的细胞结构异常，失去活性，细胞膜易被穿透，伊文思蓝可进入细胞，对死亡细胞进行染色。电导率法的原理则是将植物置于水中，细胞膜的破坏程度越高，其电解液渗出率就越高，测得的电导率值就越高。实验结果表明，GO处理的植物细胞膜损伤严重，细胞死亡率升高。SEM的测试结果表明，GO的处理使植物的根部形态发生变化。空白组的根发育正常，而1000mg/L GO溶液处理的番茄、菠菜和卷心菜的根形态发生了变化。卷心菜的根部出现膨胀的现象，番茄和菠菜的根表皮松散、损伤严重。TEM的测试结果表明，GO并未被植物吸收或在植物体内有所传播。尽管如此，GO仍然对植物具有高毒性。

Hu等研究了GO对小球藻生长的影响。在Blue-Green培养基（BG培养基）中添加GO，配制含有不同浓度（10mg/L、1mg/L、0.1mg/L和0.01mg/L）GO的培养液（GO10、GO1、GO0.1和GO0.01），用来水培小球藻。GO具有亲水性，在溶液中具有很好的稳定性，为其与小球藻的相互作用提供了基础。对小球藻细胞进行SEM表征，结果如图4-5所示。活性炭组和空白组中小球藻细胞的形态基本一致，活性炭的存在仅引发了细胞轻微的皱缩。但是暴露在GO溶液中的小球藻细胞表面形貌发生了很大变化，细胞表面产生大量的纳米级水泡，其直径尺寸在20～400nm，如图4-5（黄色箭头指示部分）所示。除此之外，GO如同外衣一样将小球藻进行包裹，厚度约为50nm，相当于几十层堆叠的GO片，如图4-5（蓝色圈指示部分）所示。小球藻表面GO的形貌特殊，如图4-5（绿色圈指示部分）所示。一些GO片垂直于小球藻生长，形成约20nm厚的锋利的GO片。一些GO片在两个小球藻之间形成连接桥，直径和长度分别小于1μm和2μm。采用TEM观察细胞的超薄切片可发现小球藻的细胞壁向外弯曲，发生了质壁分离，两个小球藻之间的GO连接桥清晰可见。用拉曼光谱对小球藻表面的GO连接桥进行检测，均得到了GO的拉曼特征峰（G峰和D峰）。同时检测到了糖类和含氮官能团的信号，这可能是小球藻在GO的胁迫下发生了应激反应，产生了渗出液，最终和GO共同构成了连接桥。通过红外检测进一步确定了GO与细胞之间的黏结是GO中的含氮官能团起主要作用。因为GO具有高比表面积和优异的力学柔韧性，很多研究曾致力于将其应用在颗粒物或微生物的包覆上。超声和涡旋流体等外界方法常被采用。而此项工作证明GO包裹细胞可自发进行，只是包裹机制尚不清楚。CNT主要通过疏水、静电、配位及氢键等作用与细胞相结合。细胞表面和GO在pH为5～8的条件下均带负电，所以可以排除静电吸附作用。这种包裹行为可能为多点连续连接，遵循吉布斯自由能最小化法则，所以很有可能为配位作用机制。

图4-5　小球藻的SEM图像

（a）（c）空白组中的小球藻；（b）活性炭组中的小球藻；（d）～（i）GO组中的小球藻（蓝色圈指示细胞表面的褶皱，黄色箭头指示水泡状结构，双白线指示GO涂层的厚度，绿色圈指示GO在细胞上的垂直生长，红色箭头指示桥状的微结构。（a）（b）中标尺为10μm；（c）～（e），（g）中标尺为1μm；（f）中标尺为5μm；（h）（i）中标尺为500nm

利用共聚焦荧光显微镜与TEM对细胞是否吸收GO进行检测，其中采用异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate,FITC）对GO进行标记。检测之前对细胞进行了深度漂洗，以排除球藻表面残留的GO所引发的荧光效应。共聚焦荧光显微镜检测结果如图4-6所示，与空白组相比，实验组细胞中具有很强的荧光信号，这说明细胞对GO有一定的吸收。TEM表征则观察到GO引发的质壁分离现象，并在细胞壁与质膜之间发现了GO。同时GO对细胞器造成了一定的损伤，增加了淀粉粒的个数，类囊体成像变模糊，细胞内叶绿素的含量也有所降低。正常细胞壁的厚度约为50nm，而GO-FITC组中细胞壁厚度减少至40nm。

图4-6

小球藻细胞的（a）（b）共聚焦荧光显微镜和（c）（d）透射电子显微镜图像（蓝色双箭头指示质壁分离，红色箭头指示无规则GO在细胞壁和质膜之间的沉积）

采用紫外可见分光光度计检测细胞的繁殖情况。空白组和活性炭组中的细胞数量随时间的增加而增加，但GO组中的细胞在第六天停止繁殖。平板计数法得到的最终细胞数量为空白组（1.98×108）、活性炭组（1.34×108）、GO10组（9.2×107）、GO1组（9.4×107）、GO0.1组（1.05×108）和GO0.01组（1.99×108）。由此可知GO对细胞繁殖有一定的抑制作用。对细胞体内一些重要的抗氧化酶，如SOD、CAT、POD的活性进行了检测，并对丙二醛（Malondialdehyde,MDA）的浓度进行了检测。结果表明，POD和CAT的活性均因GO而受到抑制，而SOD的活性未受到影响。GO有选择性地抑制了一些抗氧化酶的活性，但是各组中的MDA的浓度差别不大，所以无法判定氧化性损伤。为了进一步分析氧化应激反应，利用荧光法测试ROS的积累水平。结果表明，GO提升了ROS的积累量，这与SOD和CAT的活性受到抑制的结果一致。实验中，GO对细胞的毒性包括抑制生长和诱发氧化应激反应。对整个培养过程的pH进行监测发现，空白组的初始pH为7.3，培养结束时pH增加至7.6，变化不大。因为GO本身呈酸性，所以GO组的初始pH相对较小，但是培养结束时GO组的pH在7.2～7.6，这说明细胞对培养液中的pH有一定的调节能力。

为了探究GO对小球藻细胞代谢的影响，对多种代谢物进行提取并分析小球藻的几个主要的代谢途径，其中包括糖类代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢和尿素循环。结果表明，GO通过对某些重要代谢物的调节而干扰了糖类、氨基酸、脂肪酸和尿素的代谢。其中，糖类和氨基酸的代谢受到了抑制，这将导致机体能量供给不足。GO对脂肪酸代谢的干扰则表现为不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比率有所增加，这一结果将促进膜的流动性，便于细胞对GO进行吸收。(www.xing528.com)

以上几项研究均表明GO会提升ROS的积累水平。而细胞中的ROS会对生物大分子，如核酸、蛋白质等造成损伤，从而导致细胞死亡，植物生长缓慢。谷胱甘肽在植物组织中含量很高，而且是对ROS代谢有重要作用的抗坏血酸-谷胱甘肽循环中的重要部分。谷胱甘肽是维持细胞氧化还原平衡的关键物质。谷胱甘肽可作为底物，在谷胱甘肽过氧化酶和谷胱氨肽转移酶的作用下，对ROS进行还原分解，从而消除植物体内的ROS。被氧化的谷胱氨肽可以在谷胱甘肽还原酶的催化作用下重新转化为还原性谷胱氨肽。植物组织中被氧化的谷胱甘肽的积累量常被用来评估植物体内的氧化应激水平。谷胱甘肽氧化还原体系的平衡对植物生长至关重要。

Iqbal Ahmad小组以蚕豆作为研究对象，探究了GO对蚕豆中谷胱甘肽氧化还原体系的影响。选择蚕豆是因为其是细胞学研究的模式植物，常被用来研究化学诱变剂对植物染色体及细胞循环产生的影响。用不同浓度（0mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L和1600mg/L）的GO溶液对蚕豆种子进行水培，发芽率达80％时，取蚕豆的根进行检测。不同GO浓度条件下蚕豆谷胱甘肽氧化还原体系中谷胱甘肽含量、氧化态谷胱甘肽含量、谷胱甘肽含量与氧化态谷胱甘肽含量的比值及各种参与反应的酶（谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽磺基转移酶）活性检测结果如图4-7所示。与空白组相比，100mg/L、200mg/L、1600mg/L浓度的GO组中蚕豆的谷胱甘肽含量有所降低，400mg/L浓度的GO组对应的谷胱甘肽含量与空白组相近，而800mg/L浓度的GO组中谷胱甘肽含量有所增加[图4-7（a）]。与之相对应地，800mg/L浓度的GO组中氧化态谷胱甘肽含量较低，而200mg/L和1600mg/L浓度的GO组中氧化态谷胱甘肽含量较高[图4-7（b）]。已知谷胱甘肽和氧化态谷胱甘肽的含量，可计算出两者的比值，如图4-7（c）所示。200mg/L和1600mg/L浓度的GO组中两者的比值极低，此浓度的GO对谷胱甘肽氧化还原体系的影响很显著。800mg/L浓度的GO对谷胱甘肽氧化还原体系几乎无影响。谷胱甘肽氧化还原体系的稳态平衡是防止细胞被过度氧化或过度还原的重要缓存机制。谷胱甘肽氧化还原系统可以反映植物的代谢信息以及外界刺激对植物产生的影响，尤其是对植物体内ROS的影响。谷胱甘肽含量和谷胱甘肽含量与氧化态谷胱甘肽含量的比值水平较高时，说明细胞内是一个还原态的环境，此时植物细胞的代谢功能处于最佳状态。当植物受到外界干扰时，谷胱甘肽含量和谷胱甘肽含量与氧化态谷胱甘肽含量的比值是否能维持正常状态对蛋白质的形成和代谢至关重要。从酶活性的角度进行分析，谷胱甘肽还原酶的活性随着GO浓度的增加而增加，1600mg/L的GO组中酶的活性约高达空白组中酶活性的5倍[图4-7（d）]。该组中的谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽磺基转移酶的活性也有一定的提升。100mg/L、200mg/L和400mg/L的GO对酶活性的提升作用也较为明显，800mg/L的GO对酶活性的影响不显著[图4-7（e）（f）]。以上三种酶在植物对抗外界干扰时起着重要的作用，不同浓度的GO对酶活性的调节作用不同。100mg/L、200mg/L和1600mg/L的GO显著提升了谷胱甘肽还原酶的活性，但谷胱甘肽含量并未升高。这说明此三种浓度的GO使得植物体内积累了大量的ROS，所以植物体为除去ROS而提升谷胱甘肽还原酶的活性来进行自修复。通过增强还原酶的活性来增强谷胱甘肽的利用率，而后谷胱甘肽作为底物被过氧化物酶和转移酶氧化。400mg/L和800mg/L的GO对酶活性影响较小，细胞并未发生氧化应激反应，仍处于最佳状态。对各组中蚕豆幼苗的耐性指数进行比较，耐性指数简单来说是处理组的样品生物量与空白组样品生物量的比值，此处为处理组幼苗的平均根长与空白组幼苗平均根长的比值。按照幼苗耐性指数从低到高进行排序，对应的GO浓度分别为1600mg/L（58.2％）、200mg/L（73.2％）、100mg/L（83.6％）、400mg/L（138.5％）和800mg/L（152.8％）。显然，植物的耐性指数与之前讨论的谷胱甘肽的氧化还原体系的平衡水平一致，良好的系统平衡对应高植物耐性指数。

图4-7　GO对蚕豆幼苗谷胱甘肽氧化还原体系中各参数的影响

该小组以蚕豆为实验对象，研究了GO对蚕豆萌发的潜在作用机制。该小组记录了GO对蚕豆萌发生长的影响，并进一步对氧化应激反应中所涉及的各种参数、影响氧化应激反应的各种酶以及幼苗的蛋白质含量进行检测，以揭示GO对蚕豆生长的作用机制。同样用0mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L和1600mg/L的GO对蚕豆进行水培，幼苗的生长和含水量结果如图4-8所示。100mg/L、200mg/L和1600mg/L的GO对蚕豆种子的发芽率和根长都表现出了明显的抑制作用，而800mg/L的GO则产生了促进作用。蚕豆种子相对含水量的实验结果表明，100mg/L、200mg/L和1600mg/L的GO降低了种子的相对含水量，而400mg/L和800mg/L的GO则增加了种子的相对含水量。与100mg/L、200mg/L和1600mg/L的GO相比，400mg/L和800mg/L的GO使种子的水合作用活性提升。这可能是因为400mg/L和800mg/L的GO对种子的蛋白质和糖类的亲水基团（—NH3、—OH和—COOH）产生影响或者对种皮的脂质含量产生影响，促进种皮膨胀，从而提升种子的相对含水量，促进种子萌发和根部生长。

图4-8　不同浓度GO条件下蚕豆种子的（a）形态、（b）发芽率、（c）根长和（d）相对含水量

对可以反映ROS积累水平的三个指标（脂质过氧化产物硫代巴比妥酸反应物（TBARS）、电解质渗透率和活性羰基）进行检测，结果如图4-9（a）～（c）所示。100mg/L、200mg/L和1600mg/L的GO对这三个参数的影响均表现为促进作用。对渗透剂脯氨酸进行检测，100mg/L、200mg/L和1600mg/L的GO降低了脯氨酸的含量，而400mg/L和800mg/L的GO则增加了脯氨酸的含量，如图4-9（d）所示。100mg/L、200mg/L和1600mg/L的GO还增加了H2O2的含量，降低了抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate Peroxidase,APX）和CAT的活性，如图4-10所示。400mg/L和800mg/L的GO则增强了APX和CAT的活性。H2O2含量的增加往往伴随着APX和CAT这两种重要的过氧化氢分解酶活性的下降。H2O2含量的增加也对应着细胞膜的损伤，这里表现为TBARS含量的增加和电解质渗透率的增加。400mg/L和800mg/L的GO通过增加APX和CAT的活性控制了植物根组织中H2O2的含量，这对于植物维持细胞活性尤为重要。100mg/L、200mg/L和1600mg/L的GO对细胞膜的脂质过氧化和蛋白质氧化有促进作用，促进程度的排序为1600mg/L>200mg/L>100mg/L。TBARS和活性羰基的含量结果说明这三种浓度的GO使根细胞的脂质和蛋白质严重氧化。脂质氧化和蛋白质氧化程度是外界因素对植物产生毒性机制解析的基本参数。400mg/L和800mg/L的GO降低了膜的脂质氧化程度并增加了蛋白质的稳定性，这与之前H2O2含量的结果一致。H2O2是影响脂质和蛋白质氧化程度的一个重要因素，H2O2的低积累量和低跨膜迁移率可降低脂质和蛋白质的氧化程度。400mg/L和800mg/L的GO很可能对二硫键有所增强，从而增加了蛋白质的稳定性。Sharma等曾用Ag纳米颗粒处理芥菜，得到了脯氨酸含量下降的结果，此实验中100mg/L、200mg/L和1600mg/L的GO也降低了脯氨酸的含量。400mg/L和800mg/L的GO提升了过氧化氢分解酶活性并降低了H2O2的含量，进而得到了相对完整的细胞膜，对应着渗透剂脯氨酸的高含量。

图4-9　暴露在不同浓度GO下的蚕豆幼根的（a）脂质过氧化、（b）蛋白质氧化、（c）膜透性和（d）渗透剂水平

图4-10　暴露在不同浓度GO下的蚕豆幼根的（a）H2O2含量、（b）抗坏血酸过氧化物酶活性、（c）过氧化氢酶活性

采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳测定法对蛋白质进行分析，结果如图4-11所示。浓度为100mg/L、200mg/L和1600mg/L的GO组得到的蛋白质条带的强度比空白组弱，并且强度随着浓度的增加而减弱。800mg/L的GO对应的蛋白质条带强度最大，而且有一个新的蛋白质条带，对应的多肽相对分子质量为4～8kDa[1]，这一条带仅在此条件下可见。依据蛋白质的测试结果从分子机制的角度出发，对植物的耐受性进行分析。100mg/L、200mg/L和1600mg/L的GO导致部分多肽消失表明蚕豆根蛋白对GO的响应非常明显，蚕豆在蛋白质水平上对GO产生的胁迫进行调节。100mg/L、200mg/L和1600mg/L的GO影响的15kDa、35kDa、40kDa和55kDa的多肽很可能与氧化应激反应所涉及的一些蛋白酶有关。400mg/L和800mg/L的GO对15kDa、35kDa、40kDa、55kDa、75kDa和80kDa的多肽有增强作用，这说明这两组GO很可能促进了蛋白质的合成。800mg/L的GO组出现的新的相对分子质量为4～8kDa的多肽应该是蚕豆为提升对GO的耐受性所产生的一种新的蛋白，而且大量文献报道，4～8kDa的多肽对应着富含半胱氨酸的金属硫蛋白，金属硫蛋白可以清除机体中的自由基，具有一定的抗氧化作用。

图4-11　蚕豆幼根的蛋白质条带（箭头指示新的多肽带）

Huang等成功合成了14C标记的少数层石墨烯，并采用同位素标记法对植物中的石墨烯进行追踪和量化检测。实验中以水稻作为研究对象，将水稻在含有14C标记的石墨烯的培养液中培养，设置两组实验组，一组加入天然有机物，一组中无天然有机物。图4-12为两个实验组中水稻根和茎中石墨烯的含量。结果表明，水稻对石墨烯的吸收量依赖于培养液中石墨烯的浓度。无天然有机物的实验组中，水稻根部石墨烯的摄入量在第7天时达到最大值，而后随着时间增加呈下降趋势。添加天然有机物的实验组中，根部石墨烯的摄入量在7～21d期间内持续增加。茎中石墨烯的摄入量具有相同的趋势。天然有机物的添加，降低了植物对石墨烯的吸收，这可能源于石墨烯与天然有机物发生的相互作用。对叶片细胞的TEM表征和拉曼测试，可检测出石墨烯的特征峰，进一步证明石墨烯被植物吸收。

图4-12

（a）石墨烯培养的水稻根中石墨烯的含量；（b）石墨烯+天然有机物培养的水稻根中石墨烯的含量；（c）石墨烯培养的水稻茎中石墨烯的含量；（d）石墨烯+天然有机物培养的水稻茎中石墨烯的含量

将水稻置于无石墨烯和天然有机物的干净介质中进行净化处理。无天然有机物的实验组经过14d的净化处理，植物中石墨烯的含量降低了30％。对石墨烯的总量进行统计发现，净化14d后水稻中的石墨烯含量与净化液中的石墨烯含量之和低于净化前水稻中石墨烯的总含量，所以部分石墨烯在净化过程中发生了降解。为了进一步证明石墨烯的降解，将植物放入盒子中，收集盒子中的气体进行气相色谱分析，结果表明9％的石墨烯降解成了14CO2。利用电子自旋共振谱对叶子中的ROS进行分析，在石墨烯积累的位点处发现了ROS的积累。

将两个实验组中培养了21d的水稻移植至土壤中继续进行种植，探究石墨烯是否会在水稻果实中有所积累。对土壤中水稻的石墨烯含量进行检测，发现少量石墨烯释放到了土壤中。对土壤中石墨烯的降解进行检测，结果表明，90d后，仍有约84.3％的石墨烯残留在土壤中。对水稻的果实进行石墨烯含量的精细检测，并未检测出石墨烯。

此工作利用同位素标记法首次探究了石墨烯在植物体内的积累和转移，并证明了石墨烯虽然会被水稻吸收，但是并不会在水稻果实中积累。