腊肠亚硝酸盐检测项目优化

知识目标

能准确说出腊肠亚硝酸盐检测（盐酸萘乙二胺法）的原理。

技能目标

能按标准进行样品处理，并通过盐酸萘乙二胺法检测亚硝酸盐含量。

学习型工作任务

腊肠中亚硝酸盐的检测。

腊肠也是一种添加了硝酸盐或亚硝酸盐的肉制品。由于二者均可生成亚硝酸以及进一步反应形成毒性更强的物质，在使用硝酸盐或亚硝酸盐时要严格控制用量，产品也要严格检查亚硝酸盐的残留量。

【岗前准备】

腊肠成品；

白托盘、刀、砧板、锅、电磁炉、隔热垫板、铁盆、天平（0.01g）、分析天平（0.0001g）、组织捣碎机、可见分光光度计、恒温水浴锅、具塞锥形瓶（250mL 3个）、容量瓶（200mL 3个）、烧杯（50mL、200mL、500mL）数只、量筒（500mL、100mL、10mL）、移液管（0.5mL、1mL 2支、2mL 2支、5mL 3支、20mL）、50mL具塞比色管13支等；

水为三级水，试剂一般为分析纯，试剂配制方法如下所述。

（1）饱和硼砂 称硼酸钠5.0g溶于100mL热水中，冷却后根据实验需要的用量配制。分析纯硼酸钠带10个结晶水。

（2）蛋白质沉淀剂 亚铁氰化钾溶液（106g/L，将106.0g亚铁氰化钾用水溶解并稀释至1000mL，根据实验用量配制。分析纯亚铁氰化钾带3个结晶水）、乙酸锌溶液（220.0g乙酸锌，先加30mL冰醋酸溶解，用水稀释至1000mL。分析纯乙酸锌带2个结晶水），使用时均须一边转动一边加，以防样液中的蛋白质凝固。

（3）发色剂 对氨基苯磺酸（4g/L），0.4g溶于100mL 20%（体积比）盐酸中，置棕色瓶中混匀，避光保存。

盐酸萘乙二胺溶液（2g/L），溶解0.2g盐酸萘乙二胺于100mL重蒸水中。

（4）亚硝酸钠标准溶液（200μg/mL）精确称取0.1000g亚硝酸钠（优级，应于110～120℃干燥恒重），以重蒸馏水溶解并定容到500mL。

（5）亚硝酸钠标准使用液（5.0μg/mL）临用前，从亚硝酸钠标准溶液中取5.00mL，置于200mL容量瓶中，加重蒸水稀释至刻度，即得亚硝酸钠标准使用液。

【岗位操作】

1.岗位操作流程（GB 5009.33—2016）

粉碎腊肠并匀浆→提取亚硝酸盐→除杂→显色→比色→计算。

2.岗位操作细节（GB 5009.33—2016）

（1）粉碎腊肠并匀浆 腊肠切碎后以四分法取一定质量（准确记录质量），加入组织捣碎机中捣碎，同时量取一定量重蒸水（准确量取，记录体积）加入捣碎机中，使腊肠捣烂成肉糜。

（2）提取亚硝酸盐 试剂空白的亚硝酸盐提取和腊肠样品中亚硝酸盐提取操作应同时进行，且样品中亚硝酸盐提取必须做平行。

试剂空白的亚硝酸盐提取过程中腊肠匀浆不加，其余试剂和处理均与腊肠试样组相同。操作步骤为：加入饱和硼砂溶液12.5mL入250mL具塞锥形瓶中，继以70℃左右的重蒸水150mL混匀，置于沸水中加热15min，取出，置冷水浴中冷却，并放置至室温。然后定量转移提取液至200mL的容量瓶内。

腊肠中亚硝酸盐提取应做平行试验，以便计算精密度，操作为：称取腊肠匀浆5g（要详细记录腊肠和添加的水的质量，称量匀浆时精确至0.001g并记录）于一只250mL具塞锥形瓶中，另外称取腊肠匀浆5g（准确称重并记录）于另一只250mL具塞锥形瓶中，向两只锥形瓶中均加入饱和硼砂溶液12.5mL，分别向2只锥形瓶中加入70℃左右的重蒸水各150mL，混匀。将两只容量瓶和上面试剂空白提取的容量瓶置于同一个沸水浴中加热15min，取出，置冷水浴中冷却，并放置至室温。分别定量转移提取液入两只200mL的容量瓶内。(www.xing528.com)

（3）除杂 将三个容量瓶中的提取液（试剂空白提取液一个，样品提取液两个）振荡后，一面转动，一面分别滴加5mL亚铁氰化钾溶液，混匀，再将三只容量瓶边转动边加入5mL乙酸锌溶液，使蛋白质沉淀（一边转动一边加，是为防止样液中的蛋白质凝固）。分别向三只容量瓶中加入重蒸水至刻度，摇匀，放置30min，除去上层脂肪，将每只容量瓶中的上清液用滤纸过滤，弃去初滤液30mL后，收集滤液备用，三只容量瓶的滤液要分开放置。

（4）显色 各取试剂空白过滤液40.0mL入两支50mL具塞比色管中，分别将两组腊肠过滤液40.0mL加入50mL具塞比色管中（不得混合，且要记录滤液分别对应的匀浆的质量），再另取9支具塞比色管分别加入亚硝酸钠标准使用液0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL（分别相当于亚硝酸钠0.0μg、1.0μg、2.0μg、3.0μg、4.0μg、5.0μg、7.5μg、10.0μg、12.5μg）。然后分别向两支试剂空白管、两支试样管、九支标准管中各加入2mL对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5min后各加入1mL盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min。

（5）比色 用1cm比色杯，以零管调节零点，于波长538nm处测吸光度，绘制标准曲线，并根据试剂空白管的吸光度和样品管的吸光度计算四根比色管中对应的亚硝酸钠微克数。

（6）计算 两支样品管中溶液的吸光度查标准曲线后对应的亚硝酸钠质量分别减去试剂空白对应亚硝酸钠质量的平均值后，得到两支样品管中的亚硝酸钠质量（μg），分别标记为m′₁，m′₂。再由m₁计算X₁，由m′₂计算X₂。X₁、X₂均取二位有效数字，并根据X₁、X₂计算精密度。若精密度≤10%，则以X₁、X₂的算术平均值来报告。若精密度＞10%，则误差偏大，结果无效。

式中 X₁——第一次称取的匀浆（匀浆1）中亚硝酸钠的含量，mg/kg；

X ₂——第二次称取的匀浆（匀浆2）中亚硝酸钠的含量，mg/kg；

m′ ₁——测定用样品管1（源自匀浆1）中亚硝酸钠的质量，μg；

m′ ₂——测定用样品管2（源自匀浆2）中亚硝酸钠的质量，μg；

m ₁——匀浆1质量，g；

m ₂——匀浆2质量，g；

V ₁——测定用匀浆1过滤液体积，mL（此方法中为40mL）；

V ₂——测定用匀浆2过滤液体积，mL（此方法中为40mL）；

V₀——试样处理液总体积，mL（此方法中匀浆1和2的处理液总体积均为200mL）。

【问题探究】

1.亚硝酸盐在肉品中的作用机理是什么？

在腊肠等肉品中常加入硝酸钠或亚硝酸钠等无机盐，可使肉色鲜红并防腐。硝酸盐可转变为亚硝酸盐，亚硝酸盐与肌肉中乳酸作用，产生游离的亚硝酸（反应1），亚硝酸不稳定，特别是在加热时将分解成NO（反应2），NO与肌红蛋白结合形成对热稳定的亚硝基肌红蛋白（反应3）。这是一种鲜红色化合物，故使腊肠呈鲜红色。

亚硝酸盐除具发色作用外，还能抑制肉毒梭状芽孢杆菌。这也是它在肉制品的保藏过程所发挥的有益作用。虽然硝酸盐和亚硝酸盐有毒，但只要控制它们的加入量，则危害就可以减轻或避免。

2.亚硝酸盐的检测原理是什么？

亚硝酸盐在盐酸溶液中，与芳香族胺，如对氨基苯磺酸（H₂N-C₆H₄-SO₃H）发生重氮化反应产生重氮盐，此重氮盐遇偶合试剂盐酸萘乙二胺生成紫红色偶氮染料。此染料的颜色随亚硝酸盐的浓度增加而加深，或称与样品中亚硝酸盐的浓度成正比。因此，可采用分光光度计比色测定。

3.做试剂空白、样品平行的目的是什么？

做试剂空白是为了消除试剂可能产生的误差；做样品平行是为了计算试验的精密度，衡量结果的可靠程度。

4.试剂空白、样品空白与标准空白如何区分？

试剂空白一般指样品检测过程中与样品处理相同但不加样品所作的空白；标准空白就是本任务中标准曲线制作时，标准品（此任务中为亚硝酸钠标准品）添加量为0的那支标准管；样品空白是与样品处理步骤一致，只是不加显色剂（此任务中为对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺）的空白，肉制品中添加色素后常需做样品空白。