如何正确计数盐水火腿的大肠菌群？

知识目标

能说出大肠菌群定义及检测原理。

技能目标

会按标准要求处理样品，并进行大肠菌群（最近似数法）检测。

学习型工作任务

盐水火腿中大肠菌群计数。

盐水火腿属于低温肉制品，并且水冷等环节极易造成微生物污染，故一般情况下，产品中仍然会存在一定数量的微生物。其中，大肠菌群指标是一项至关重要的食品安全指标，是出厂检验及型式检验的必检项目。本项目采用GB 4789.3—2016的第一法，即最可能数法（MPN法）推算盐水火腿中大肠菌群浓度。

【岗前准备】

自制盐水火腿；

无菌海砂或玻璃砂、LST培养基、BGLB培养基；

天平（0.1g、0.01g）、灭菌锅、微生物培养箱、无菌室或超净工作台、生物显微镜、无菌刀、无菌绞肉机或可灭菌的组织捣碎机（或拍击式均质器及无菌均质袋）、冰箱、移液管、试管（具倒置的德汉氏小管）、玻璃棒、500mL锥形瓶、玻璃棒、量筒（500mL，100mL）、酒精灯、无菌手套、灭菌乳钵、无菌铁药匙等。拍击式均质器如图4-8所示。

图4-8 拍击式均质器

（http://www.hz-lnb.com/ProductView_321.html）

【岗位操作】

1.岗位操作流程

取样→样品封存→试剂与仪器准备→样品处理→初发酵→复发酵→结果判定。

2.岗位操作细节

（1）取样 同感官检验，根据检测需要选择恰当的取样方法。

（2）样品封存 将盐水火腿样品装入无菌容器后，贴上标签，标签上应包括：取样人员和取样单位名称；取样地点和日期；样品的名称、等级和规格；样品特性；样品的商品代码和批号。采样人员同时认真填写取样报告（内容应包括样品标签要求的信息；被取样单位名称和负责人姓名；生产日期；产品数量；取样数量；取样方法；取样目的、会对样品造成影响的气温和空气湿度等包装环境和运输环境，及其他相关事宜。）一般应立即送检，若冷藏，最好不超过3h。

（3）试剂与仪器准备 估计盐水火腿中可能的大肠菌群数量，选择所需检测的稀释度。按GB 4789.3—2016的要求配制两种液体培养基，根据稀释度的要求准备大、小试管，德汉氏小管并分装液体培养基。采用九管法，每组要准备三根双料LST肉汤管。将刀、剪刀、移液管等分别准备好（包好，刻度吸管塞上脱脂棉）灭菌备用；将海砂或玻璃砂包好高温灭菌待用；乳钵若太厚不能进行高温灭菌则用化学消毒剂溶液浸泡后，以无菌水冲净（若用医用酒精浸泡不需再冲洗），至超净工作台或无菌室紫外线消毒，组织捣碎机（均质杯）消毒方式同乳钵，拍击式均质器一般用酒精棉擦拭消毒并使用无菌一次性均质袋。准备生理盐水（或磷酸盐缓冲液），分装225mL入500mL锥形瓶，以及根据稀释度要求准备数支装有9mL生理盐水的试管。分装6支LST发酵管一起高压灭菌后，冷却待用。(www.xing528.com)

（4）样品处理 按GB/T 4789.17—2003的要求，盐水火腿（各类熟肉制品均同样操作）直接切取25g，放入灭菌乳钵内用灭菌剪刀剪碎后，加灭菌海砂或玻璃砂研磨，磨碎后加入无菌生理盐水225mL，混匀，即为10^-1稀释液（此步骤参照GB 4789.3—2016，也常称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1 ∶10的样品匀液），随后移取1mL此稀释液入预装有9mL无菌生理盐水的试管中，混匀，即为10^-2稀释液。分别取10^-1稀释液10mL接种3根双料LST肉汤管，分别取10^-1稀释液1mL接种3根单料LST肉汤管，再分别取10^-2稀释液1mL接种3根单料LST肉汤管。全过程控制在15min以内。

（5）初发酵 接种过的LST肉汤管于（36 ±1）℃，培养（48 ±2）h，观察有无产气现象。若（24 ±2）h就发现产气的试管则立即接种BGLB管做验证试验；（24 ±2）h不产气但是（48 ±2）h培养后产气的试管同样需要做验证试验。注意做好标记。

（6）复发酵 产气管接种BGLB管做验证试验，若（36 ±1）℃，（48 ±2）h培养后出现气泡，则判断原LST肉汤管为阳性管，否则判为阴性管（详见GB 4789.3—2016流程图）。

（7）结果判定 根据每个稀释度下的阳性管数查MPN表，推算并报告结果。

【问题探究】

1.盐水火腿大肠菌群计数的稀释度如何确定？

一般根据经验。如果经验不足，也可以根据盐水火腿的大肠菌群指标的数值来推测产品中大肠菌群可能的浓度范围，再根据MPN表推算出适宜的稀释度。

2.样品处理如何做到“零”污染？

盐水火腿等食品进行微生物检测取样时必须做到无外界污染。包装袋开口处和操作员的手臂要用棉球擦拭消毒，刀、剪刀、容器等均需提前灭菌备用，还需自带酒精灯、冰袋、样品保温盒等设备。取样时一般需要在开口附近点燃火焰，防止空气造成的污染。

样品在切碎、搅碎、称量、稀释和接种时，也要使用无菌器皿，并在酒精灯火焰附近操作。触碰样品时应穿戴无菌手套。

其他一些设备和器具要注意采用恰当的消毒方式。如，研钵较厚，不能加热。所以一般在洗净后用医用酒精浸泡，再以无菌水冲净后至紫外灯下辐照、晾干备用。通过化学消毒和辐射消毒的方式来消除微生物的污染。若采用漂白粉溶液或其他强杀菌剂溶液，应该将溶液用无菌水彻底冲洗干净，再置于紫外线下消毒备用。组织捣碎机（均质杯）消毒方式同乳钵，拍击式均质器一般用酒精棉擦拭消毒并使用无菌一次性均质袋。超净工作台或无菌室应在清洁后用紫外线消毒备用。

【知识拓展】

1.盐水火腿出厂检验结果如何判定？

出厂检验是出厂前必须逐批进行的，检验合格后出具产品合格证书附于包装箱外方可出厂。出厂检验时感官、包装、净含量、菌落总数、大肠菌群为每批必检项目，其他项目作为不定期抽检。

出厂检验项目全部符合GB/T 20711—2006要求的判为合格产品；出厂检验项目中有一项（菌落总数和大肠菌群除外）不符合GB/T 20711—2006的，可以加倍随机抽样进行该项目的复验，复验后仍不符合GB/T 20711—2006的，判为不合格产品；菌落总数和大肠菌群中有一项不符合GB/T 20711—2006的，判为不合格产品，不应复验。

2.盐水火腿型式检验结果如何判定？

盐水火腿型式检验应包括感官检验，理化检测（水分、食盐、蛋白质、脂肪、淀粉、亚硝酸钠、污染物），微生物检测，生产加工过程卫生控制（GB 19303—2003）。

型式检验时项目全部符合GB/T 20711—2006要求，判为合格品；型式检验时不超过3个项目（菌落总数、大肠菌群和致病菌除外）不符合GB/T 20711—2006，可以加倍抽样复验，复验后有一项不符合GB/T 20711—2006的，判为不合格品，超过3项不符合GB/T 20711—2006，不应复验，判为不合格；菌落总数、大肠菌群和致病菌中的一项不符合GB/T 20711—2006的，判为不合格品，不应复验。