快速检测食品原料中的转基因成分

任务引入案例

四洲集团热销零食未标注含转基因成分

2009年11月，广东省工商局首次公布对市场上转基因食品的抽检结果，四洲集团一款热销的零食“卡乐B 龙虾味粟一烧”被发现含转基因成分却未标注。该局也因此成为国内第一个公布对转基因食品质量抽检结果的政府监管部门。

转基因食品与辐照食品一样，对其食用的安全性目前国际上仍存在较大争议。我国明文规定，这两类食品都必须在包装上标注转基因和辐照，以给消费者自由选择的知情权。此次广东工商局共对21批次可能含转基因成分的食品进行了抽检，“Bar基因、NPTII基因”等5个检验项目均只针对食品中是否含转基因成分进行判定，不涉及食品的其他质量问题。检验发现，在深圳万福佳盛百货公司观澜商场抽检到、标称卡乐B四洲（汕头）有限公司生产的一批次“卡乐 B 龙虾味粟一烧”（80克/包，生产日期2008-11-07），被检出含转基因成分却未按国家规定在包装上标注“转基因××食品”。

据悉，早在去年7月，国际环保组织“绿色和平”就曾在香港发布抽查结果，称包括内地生产的“卡乐B 粟一烧”在内三种热门零食含有基因改造成分却未标注。当时四洲集团并不认可这一结果，强调“卡乐B粟一烧”不含转基因成分。

省工商局有关人士说，2002年的《转基因食品卫生管理办法》也规定：转基因食品要标注“转基因××食品”或“以转基因××食品为原料”。由于绝大多数的监管部门至今没把转基因和辐照的标注问题列入日常监管，因此许多企业未在食品包装标注“转基因××食品”。

省工商还发出消费指引：儿童慎食转基因食品。虽然目前国际上并无实例直接证明转基因产品对人体健康有害，但婴幼儿比成人更容易对食品敏感，而长期进食某种食品，会令婴儿成为食品安全的高风险群体。

任务介绍

随着转基因作物的商业化种植以及转基因技术的不断发展，抗病、抗虫、耐除草剂、抗逆境和高产优质等转基因产品越来越多，应用也越来越广泛。转基因产品给人们带来便利和经济利益的同时，也带来了安全性问题的争议，鉴于食用安全长期效应无法确证等问题，当前的研究成果尚不能对转基因安全给出准确、全面的结论。为加强对转基因产品的管理，转基因产品成分检测技术尤为重要。目前，转基因产品检测技术主要分为两类，一是基于外源核酸的检测技术，主要包括定性PCR技术、定量PCR技术、等温扩增技术和基因芯片技术等；二是基于外源蛋白的检测技术，主要包括酶联免疫吸附技术、Western blot 检测技术和试纸条技术等。

一、基于外源核酸的检测技术

核酸是绝大多数生命体的遗传物质，具有较高的稳定性和普遍性，因此以脱氧核苷酸（DNA）为靶标的检测技术是目前最成熟、应用最广泛的转基因产品检测技术。根据外源DNA片段序列特征和插入位置的不同，核酸检测可以对筛选元件特异性、基因特异性、载体构建特异性和转化事件特异性四个方面进行检测。基于外源核酸的转基因检测技术主要有：定性PCR技术、定量PCR技术、等温扩增技术和基因芯片技术等。

1. 定性PCR技术

定性PCR也称为普通PCR，是一种基于聚合酶链式反应的检测技术，是目前应用于转基因检测最广泛的方法。此法不受材料加工程度的影响，可以对种子到终产品的转基因成分进行定性检测，且灵敏度高、操作简便，成为许多国家用于市场筛查转基因成分的首选方法，如巴西、科威特、伊朗、沙特阿拉伯、约旦、塞尔维亚及叙利亚等国家。普通PCR单次反应只能检测特定靶序列，无法满足大量、快速的转基因产品检测需求。

2. 定量PCR技术

目前，越来越多的国家通过设定阈值对转基因产品进行标识管理，转基因成分含量超过设定阈值的转基因产品必须强制性标识，如欧盟为0.9%，澳大利亚、巴西为1%，马来西亚、韩国为3%，日本、中国台湾地区为5%。随着世界各国转基因产品标识制度的发展和完善，应用定量PCR技术对转基因产品进行定量标识将越来越广泛。定量PCR技术主要有竞争性定量PCR技术（Competitive quanti-tative PCR，QC PCR）、实时定量 PCR 技术（Real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR）和数字 PCR 技术（Digital PCR，D PCR）3种。竞争性定量PCR通过向PCR反应体系中加入与目标DNA具有相同扩增效率和引物结合位点的竞争模板，同时以不同稀释梯度的竞争模板建立标准曲线，从而计算目标DNA的含量。实时定量PCR通过荧光标记实时监控目的片段的扩增，根据待测物起始浓度与循环阈值（Threshold Cycle，Ct值）线性相关的原理，从而实现靶标基因的精确定量，已广泛应用于转基因产品的定量检测。实时定量PCR检测技术已被广泛应用于大豆、玉米、水稻、菜豆、棉花、茄子、木瓜、酿酒酵母中的转基因成分检测，操作简便、灵敏度高，但成本较高，存在重现性较差的问题。数字PCR是一种基于泊松分布原理的针对单分子目标DNA的绝对定量技术。相对实时定量技术，数字PCR不需要对每个循环进行实时荧光测定，也不需要Ct 值来定量靶标。数字PCR通过将反应试剂平均分配到几万至上千万个单元中，从而使靶标DNA 稀释到单分子水平。扩增结束后，通过直接计数或泊松分布计算得到样品的原始拷贝数，因此其不受扩增效率的影响，也不必使用内参基因和标准曲线，具有极高的准确度和重现性。目前，数字PCR已应用于转基因玉米、水稻、大豆及深加工产品中的定量检测中。

3. 等温扩增技术

等温扩增技术是指在一个恒定温度下，通过不同活性的酶和各种特异性引物来实现DNA扩增的方法，相对PCR扩增技术，具有快速、高效、特异的优点，且无需专用设备，在临床和现场快速诊断中应用广泛。主要方法：环介导等温扩增（LAMP）、滚环核酸扩增（RCA）、核酸序列依赖性扩增（NASBA）、链替代扩增（SDA）和解链酶扩增（HAD）等。LAMP技术对设备要求低，具有直观、高效的特点，已经成为出入境检验检疫等行业标准转基因成分检测的一种指定方法，未来仍需克服假阳性较高、引物设计要求高等不足。

4. 基因芯片技术

基因芯片技术是基于核酸杂交的一项高通量检测技术，利用固体在基质表面的上千个特定探针与标记的样品进行杂交，通过分析杂交信号，能够一次性准确地对样品中不同种类的DNA序列进行定性、定量的筛查，已被广泛应用于转基因检测等许多领域。基因芯片技术满足当前转基因高通量、自动化检测的需求，但其成本较高、芯片合成复杂、背景干扰严重等不足，一定程度影响了该技术的广泛应用。

二、基于外源蛋白的检测技术

基于外源蛋白的转基因检测技术是以免疫分析技术为基础的对转基因产品的外源表达蛋白进行定性和定量检测的一种技术。常见的方法主要包括：酶联免疫吸附技术、蛋白质印迹法检测技术和试纸条技术等。

1. 酶联免疫吸附技术

酶联免疫吸附技术（ELISA）通过抗原和抗体的可视免疫反应来检测和鉴定目标蛋白，主要包括双抗夹心法、直接法、间接法，其中灵敏度最高的双抗夹心法应用最为广泛。目前，我国对于已获生产应用安全证书的转基因抗虫棉的衍生品系进行安全评价检测时，采用ELISA检测技术对抗虫棉不同组织部位中Bt蛋白的表达量进行检测，从而对抗虫棉品种的抗性能力进行科学评价。

2. 蛋白质印迹法检测技术

蛋白质印迹法检测技术本质是一种蛋白质转移电泳技术，其原理是将聚丙烯酰胺凝胶上分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，利用抗体反应和显色酶反应实现对转基因产品中外源蛋白的有效检测。虽然蛋白质印迹法技术操作较为繁琐，也无法满足快速高效的检测需求，但其可以有效地检测转基因产品中的不可溶蛋白。

3. 试纸条技术

试纸条技术是基于免疫层析的一种快速检测技术，较之ELISA 法要更为简便、快速，可在5～10min的时间内现场观测结果，在转基因产品大规模快速筛查检测中应用广泛。许多公司针对不同转基因植物中特异表达的外源蛋白，开发出大量特异的免疫层析试纸条，如检测孟山都公司转基因Round up Ready 大豆和油菜中CP4-EPSPS 蛋白的试纸条、Starlink玉米中Cry9c 蛋白的试纸条等。中国农科院油料所研制的Cry1Ab/Cry1Ac 试纸条，成本为进口产品的40%，灵敏度等性能参数与进口试纸条相当，是原农业部推荐使用的产品之一。由于试纸条技术具备操作简便快速、特异性强、成本低廉等优点，其发展和应用较为迅速。

试纸条法测试的速度和便利对于农产品中转基因提供了实质性的帮助，但这类测试的一个重要限制是，并不是所有的转基因都编码成一个单独的靶检测蛋白。因此，试纸条法测试并不是对所有的商业化转基因作物有用。试纸条法测试的另一个弊端是，测试的敏感性不如PCR检测方法。例如，试纸条法对转基因的测试范围通常在0.1%～1%，而PCR（DNA）测试方法更敏感，检测的DNA 含量最低为0.01%。试纸条法测试对经过高温或化学处理加工的转基因产品也不适用，比如大豆分离蛋白、卵磷脂等。因为这些蛋白发生变性导致特异结合位点破坏。加工产品的蛋白质比DNA更容易降解，因此，基于蛋白的试纸条法测试不适合检测经过加工的转基因产品，然而，基于DNA的PCR检测方法适合多种类型转基因产品。随着试纸条技术不断完善，克服假阴性、假阳性和背景色较重的问题，提升灵敏度和实现多元检测，试纸条在转基因检测中将发挥更重要的作用。

任务实操

免疫层析法快速检测食品原料中转基因成分

1. 产品简介

本产品用于快速检测植物叶片和种子等样品中的转基因Bt CryAb/Ac，灵敏度为1%，整个检测过程只需要8～10min，适用于各类企业及检测机构。

2. 检测原理

转基因Bt CryAb/Ac 免疫金标速测卡应用双抗体夹心免疫层析的原理，样本中的抗原在侧向移动的过程中与胶体金标记的特异性单克隆抗体1结合，形成抗原-抗体复合物，继续向前方流动，和NC 膜检测线上特异性单克隆抗体2的结合形成双抗体夹心复合物。如果样本中抗原含量大于1%，检测线显红色，结果为阳性；反之，检测线不显色，结果为阴性。

3. 产品组成

转基因Bt CryAb/Ac 免疫金标速测卡（40份/盒）；说明书（1份/盒）；塑料吸管（40个/盒）；提取缓冲液（5mL/支，4支）(www.xing528.com)

4. 样品处理

（1）植物叶片组织

①将植物叶片组织置于一次性组织提取管的盖子与管身之间，迅速盖住盖子，得到圆形叶片组织。用杵将叶片置于提取管的底部。用记号笔在管壁做好标记。

②将杵插入管中，旋转杵碾搅碎叶片，持续按压20～30s。

③加入0.5mL（约20滴）提取缓冲液。

④重复碾碎步骤使样品与缓冲液充分接触混合。拿掉杵棒（注意请将杵棒一次性使用，以免不同样品间交叉污染）。

（2）提取植物种子

①取一粒植物种子，压碎，转移到做好标记的提取管中。注意：充分压碎能够提高测试准确度。

②加0.5mL（约20滴）提取缓冲液溶解。

③盖好提取管的盖子，用力上下振荡提取管20～30s，确保样品与缓冲液充分混匀。静置等待固体物质沉淀在管底。

④请注意不要交叉污染，每个样品采用单独的提取管。

5. 使用步骤

（1）测试前请完整阅读使用说明书，并将试剂板和待检样本溶液恢复至常温；

（2）从包装袋中取出试剂板后请尽快使用；

（3）用滴管吸取待检样品溶液，于加样孔中滴加3滴（约75μL），加样后开始计时；

（4）结果应在8～10min读取；

（5）读取结果时，试剂板水平置于观察者正面。

6. 结果判断

阴性（-）:T线不显色（测试线，靠近加样孔一端）；

阳性（+）:T线显色，肉眼可见；

无效：未出现C 线，可能操作不当或试剂板已失效。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试剂板重新测试。

7. 注意事项

（1）请勿触摸试剂板中央的白色膜面。

（2）请勿使用过期的试剂板。

（3）提供的滴管请勿重复使用。

（4）提供的试剂请勿食用。

（5）若需直接检测标准品，请用产品自带的PBS 缓冲液进行配制。

（6）自来水、蒸馏水或去离子水不能作为阴性对照。

（7）由于样本的差异，有的检测线可能偏淡或颜色偏灰，但只要出现条带，就可判定为阴性结果。

（8）样本中的固体杂质颗粒会导致假阳性结果，取样时弃去肉眼可见的颗粒部分，有条件时请离心后取上清液做检测。

任务拓展

拓展一 转基因食品的安全性。

拓展二 我国对转基因原料的规范。

拓展一～拓展二