快速检测玉米赤霉烯酮的方法优化

任务引入案例

山东德州某规模养猪场，存栏母猪300多头，自2017年3月份一些母猪和3～5月龄的仔猪开始出现临床症状。病猪一般体温正常，母猪发情期延长或假性妊娠，分娩时产程长，难产现象比以前增加，死胎数增多，5月份大约有10%的死胎；仔猪下痢，排黄色或黄绿色稀便，并常见里急后重，部分发病仔猪出现直肠脱垂。虽然用多种抗毒、抗菌止痢药进行治疗，但病情仍不见明显好转。在检查仓库玉米时，发现库存玉米中有很多霉变，破碎的玉米粒，颜色淡红色，典型的霉变现象。跟猪场负责人沟通时，负责人反应在3月份使用该批玉米后，猪场开始出现的问题。结合猪群的临床症状，诊断为玉米赤霉烯酮中毒。

任务介绍

玉米赤霉烯酮（Zearalenone）又称F-2毒素，它首先从有赤霉病的玉米中分离得到。玉米赤霉烯酮其产毒菌主要是镰刀菌属（Fusarium）的菌侏，如禾谷镰刀菌（F.graminearum）和三线镰刀菌（F.tricinctum）。玉米赤霉烯酮主要污染玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物。

玉米赤霉烯酮一般用薄层色谱、高效液相色谱法检测，但因其操作繁杂，费用昂贵而影响实际应用。而使用玉米赤霉烯酮ELISA 试剂盒能够快速而准确分析样品中玉米赤霉烯酮残留。

任务实操

玉米中玉米赤霉烯酮ELISA试剂盒快速检测

1. 适用范围

可用于定量、定性检测饲料、玉米等样本中玉米赤霉烯酮的残留。

2. 方法原理

酶联免疫法测定抗原主要有四种方法，竞争法、双抗体夹心法、改良的双抗体夹心法和抑制性测定法。

本试剂盒采用间接竞争酶联免疫法，在微孔板上预包被玉米赤酶烯酮偶联抗原，标准品或样本中的玉米赤酶烯酮与微孔板上的抗原竞争结合抗玉米赤酶烯酮抗体，加入酶标二抗后，用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺TMB显色（TMB 是非常优越的酶免试验显色剂底物），样本吸光值与其所含玉米赤酶烯酮的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中玉米赤酶烯酮的含量。

3. 操作方法

样品处理程序

（1）称取5g具有代表性的粉碎样品于100mL 带塞三角瓶内，准确加入25mL 60%（体积分数66.7%）甲醇水溶液。

（2）将加入了甲醇水溶液的样品放入振荡器内（或用手强力振荡），充分振荡3min后，用滤纸过滤，收集滤液。

（3）取滤液2mL，加入6mL 20%（体积分数25%）甲醇水溶液，混匀，用滤纸过滤，此为样品待检液。

定量检测程序

（1）实验准备 从冰箱取出试剂盒，恢复至室温后，打开自封袋，取出所需数量的板条插入微孔架，记录空白、标准品①②③④⑤号及样品的位置（可参照表3-5所示）。其余板条封口后放入冰箱。将浓缩洗涤液用超纯水或蒸馏水稀释20倍，待用。

表3-5 酶联免疫法空白和样品布板(www.xing528.com)

（2）加样 空白孔加入100μL 洗涤液（不加抗体）。标准品孔和样品孔相应地加入标准品（①②③④⑤）和样品待检液50μL/孔（如表3-5所示加入），再加入抗体（50μL/孔），此时各孔中溶液体积为100μL。将酶标板在水平桌面上轻微振荡（注意避免液体溅出），使之混匀，放入湿盒内（在有盖容器内放置一块平整湿纱布），37℃温育30min。注意：此操作步骤要快，尽量保持前后孔温育时间一致，每次加样须更换新的吸头。

（3）洗板 甩出孔中的液体，用洗瓶或移液器将洗涤液加入各孔中（满孔），再次甩出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打以除去孔中的液体，再重复操作洗涤步骤三次（共洗四次）。

（4）加酶标二抗 将洗好的酶标板平放，加入酶标二抗100μL/孔，置于湿盒内，37℃温育30min。

（5）洗板，参照步骤（3）。

（6）显色 将洗好的酶标板平放，加入显色液100μL/孔，37℃显色5min（若显色较浅，可适当延长，但不宜超过10min）。

（7）终止及测定 将显色完毕的酶标板取出，加入终止液50μL/孔，轻微震荡混匀，以空白孔调零，在450nm处测量吸光值A（在加入终止液5min 内读取吸光值）。

4. 结果判定

以标准品浓度30μg/L、60μg/L、200μg/L、500μg/L的常用对数值（1gC）为横坐标，各浓度标准品相应的吸光值A与0μg/L 的标准品A值的比值（B/B₀%）为纵坐标，[B/B₀% =标准品（或样品）的吸光值/0μg/L 标准品的吸光值 × 100%]，绘制标准曲线。

根据样品孔的吸光值计算样品的B/B₀%值，查标准曲线，可得到相应样品中的含量（已考虑样品提取的稀释倍数，结果无需换算，或可直接用RADEWIN 等专用ELISA分析软件对数据进行分析得出结果）。如果检测结果高于检测上限，请将待测样品提取液用30%甲醇水稀释后再检测，测定结果乘以相应的稀释倍数。

5. 注意事项

（1）某些样品待检液（如花生等）久置影响检测结果的准确性，为保证检测的准确性，样品提取后请即时检测。

（2）若样品待检液不立即检测，请将其存储于棕色玻璃瓶内，2～8℃避光保存。

（3）试剂盒在使用前，请将试剂盒内所有试剂放到室温（20～25℃）进行温度平衡。试剂用完后立即将其放置回2～8℃冰箱内保存。

（4）在每个步骤操作时，速度要快，不要使板孔暴露在空气中时间过久，避免酶标板变干。未用完的酶标板需密闭于自封带内，防止受潮且避光保存于2～8℃冰箱内。

（5）在温育时，避免光照，建议将酶标板置于湿盒内（在有盖容器内放置一块平整湿纱布）进行温育。

（6）若样品数量超过20份，请用多通道加样器操作。

任务拓展

国标中规定的食品中玉米赤霉烯酮限量指标。

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