食品原料中常见致病菌的快速检测方法

任务引入案例

从墨西哥进口木瓜已致一百多名美国人感染沙门氏菌

据英国《每日邮报》2017年8月8日报道，目前已有100多名美国人因墨西哥进口的木瓜而感染了沙门氏菌，美国的卫生官员正在努力控制疫情。进口木瓜已引起逾百例沙门氏菌病例，其中1人死亡，35人住院。疫情出现在了美国的16个州。美国食品药品管理局正与墨西哥一道监控从引发疫情的地区进口的木瓜。

美国疾病控制与预防中心透露，目前已有100多名美国人因从墨西哥进口的木瓜而患病。两周前首次报道的这次疫情，可追溯至位于海湾和危地马拉之间的墨西哥坎佩切州某农场。该农场的木瓜对5种不同的沙门氏菌菌株检测都呈阳性，这些细菌会导致腹泻、呕吐、胃痛和发烧。幼童、老年人和免疫系统较弱的人可能出现严重感染。

任务介绍

食品致病菌是以食品为传播媒介引起食源性疾病的致病性细菌。致病菌直接或间接污染食品原料，人经口感染可导致肠道传染病的发生及食物中毒。食源性致病菌是导致食品安全问题的重要来源。常见食品原料中致病菌主要有致病性大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌等。

（1）致病性大肠杆菌 根据致病机制不同又可分为产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、肠致病性大肠杆菌（EPEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、肠道聚集黏附性大肠杆菌（EAEC）和产志贺氏样毒素大肠杆菌（SLTEC）六类。各类致病性大肠杆菌可引起婴儿或成人腹泻，当其污染食品或饮水后，可引起细菌性食物中毒或水源性腹泻病暴发流行。

（2）沙门氏菌 大多数食源性疾病发病的主要原因。沙门氏菌是一类广泛分布于自然界肠杆菌科中一种重要的人畜共患、革兰阴性病原菌。不仅能导致鸡白痢、鸡伤寒、副伤寒、仔猪副伤寒、流产等多种动物疾病，而且在世界各地的食物中毒中沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第二位。沙门氏菌菌型繁多，已确认的沙门氏菌有2500个以上的血清型。繁杂的各类生化反应型使常规检验程序复杂繁琐、耗时费力，不仅给检验部门带来沉重的负担，而且还使生产部门产品运转和仓贮的时间延长，费用增加，因此多年来建立快速而准确的检测方法一直是沙门氏菌检验研究的核心问题。目前主要采用传统标准检测方法、分子生物学方法、免疫学方法等。GB 4789.4—2016是目前我国规定的对畜产品中沙门氏菌的标准检测方法，主要是根据沙门氏菌的生化特性进行前增菌、选择性增菌、分离培养、生化鉴定和血清分型五个步骤，需时4～7d才能得出明确的诊断结果。分子生物学方法包括核酸探针、扩增片段长度多态性技术、PCR技术和基因芯片技术。免疫学检测方法包括酶联免疫吸附法、斑点酶联免疫吸附、免疫磁性分离技术、免疫荧光标记、自动酶标免疫检测仪。

（3）霍乱弧菌 霍乱的病原菌，引起一种急性肠道传染病，发病急、传染性强、病死率高，属于国际检疫传染病。霍乱弧菌分为两类：O₁群霍乱弧菌及非O₁群霍乱弧菌和O₁₃₉群霍乱弧菌。霍乱弧菌在形态和生物性状上都相似，呈逗点状、香蕉状，革兰阴性菌，无芽孢，无荚膜，单鞭毛，运动性强。

（4）阪崎肠杆菌 又称阪崎氏肠杆菌，是肠杆菌科的一种，1980年由黄色阴沟肠杆菌更名为阪崎肠杆菌。阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，死亡率高达50%以上。目前，微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌的污染来源，但许多病例报告表明，婴儿配方乳粉是目前发现的主要感染途径。

（5）金黄色葡萄球菌 隶属于葡萄球菌属，有“嗜肉菌”的别称，是革兰阳性菌的代表，可引起许多严重感染。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，在美国，由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占到45%，中国金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件也时有发生。中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%，所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。

任务实操

实操一 原料中沙门氏菌的酶联免疫吸附法快速检测

1. 适用范围

食品原料中的沙门氏菌检测。

2. 实验原理

酶联免疫吸附法现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫技术基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，采用抗原与抗体特异反反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定（图3-4）。

3. 实验步骤

（1）加样 加一定稀释的待测样品0.1mL 于已包被异性抗体之反应孔中，置37℃孵育1h，然后洗涤，同时做空白孔、阴性对照及阳性对照孔。

（2）加酶标抗体 于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1mL，37℃孵育0.5～1h，洗涤。

图3-4 酶联免疫吸附法原理

（3）加底物液显色 于各反应孔中，加入临时配制的底物溶液0.1mL，37℃孵育10～30min。

（4）终止反应 于各反应孔中加入2mol/L硫酸0.05mL。

（5）结果测定 置于酶标仪上测定各孔的OD值，并记录结果，读数在加终止液10min内完成。

4. 结果判读

（1）临界值（CO，cutoff）的计算：临界值=阴性对照孔OD均值×2.1。

（2）阴性对照孔OD（optical density）均值大于0.1时重新实验，小于0.05时以0.05计算，结果判定：样品OD值S/CO=1者为阳性，样品OD 值S/CO=1者为阴性。

5. 注意事项

（1）所有样品按传染源处理。

（2）加试剂前应混匀，力求滴加准确。

（3）加样应加在板孔的底部，避免产生气泡并迅速完成。

（4）洗涤时各孔均需加满，洗涤必须彻底，防止产生假阳性。

（5）温育的时间要严格控制。

实操二 乳粉中阪崎肠杆菌荧光PCR检测

1. 适用范围

PCR技术是一种特定的核酸片段在体外进行快速扩增的方法；非传统克隆模式，无需活细胞；高效率，在数小时内可扩增10⁷～10⁸倍；广泛应用于病毒细菌的DNA和RNA的检测。

2. 实验原理

PCR技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA 聚合酶的酶促合成反应。DNA 聚合酶以单链DNA 为模板，借助一小段双链DNA 来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA 模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA 聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此为起始点，沿模板5′→3′方向延伸，合成一条新的DNA互补链。

3. 检测步骤

（1）标本取样 取样前消毒样品包装的开启处和取样工具。按照“三管”增菌法，无菌称取100g、10g 和1g样品各三份，分别加入2L、250mL、125mL的样品稀释瓶中，加入9倍预热到45℃的灭菌水（1:10稀释），或者将样品直接称量到装有9倍预热的45℃灭菌水的样品稀释瓶中，振荡使样品充分混匀，36℃±1℃培养18～22h。

分别移取培养18～22h的悬液各10mL加入90mL肠杆菌增菌肉汤（EE 肉汤）中，36℃±1℃培养18～22h。

（2）试剂制备 取出反应管N支（N=样本数+1管阳性对照+1管阴性对照），快速离心后，存于4℃备用。

（3）DNA提取 标本处理：每瓶培养的EE 肉汤分别取1mL 加到1.5mL 无菌离心管中，8000r/min 离心5min，尽量吸取去除上清液；加入50μL DNA 提取液（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混匀后沸水浴10min，12000r/min离心5min，取上清液2μL做模板进行PCR反应。(www.xing528.com)

（4）PCR扩增

①加样：取出备用的PCR反应管，分别加入处理后的样品上清2μL，阴阳性对照直接加2μL，瞬时离心后放入仪器样品槽进行PCR反应。

②编辑：点击新建文件，输入实验文件名称；对应样品槽样本放置顺序设置阴、阳性对照以及未知标本，并在Name 栏中设置样品名称。

换到温度设置窗口设置循环条件（表3-4）:

表3-4 温度设置窗口设置循环条件

步骤3 中60℃时读取荧光值。

编辑完成后点击开始运行，出现热盖温度是否等待，请点击“是”。

（5）试验有效性判定 设定阈值线高于阴性对照最高点，阳性对照的 Ct 值≤25.0，反应有效。

4. 结果判定

设定阈值线高于阴性对照最高点，检验样本Ct值小于或等于25.0时，报告阪崎肠杆菌筛选阳性；检验样本Ct值大于25.0且小于30.0时，重复一次，如果Ct值仍小于30.0，且曲线有明显的对数增长期，可报告阪崎肠杆菌筛选阳性，否则报告阪崎肠杆菌未检出；样本检验不到Ct值，或Ct值为0时，报告阪崎肠杆菌未检出。

5. 注意事项

（1）实验室应专门辟出 RN A 操作区，离心机、移液器、试剂等均应专用。RN A操作区应保持清洁，并定期进行除菌。

（2）在超净台中按照细胞培养的要求进行操作，可以有效避免操作中引起的RN A酶污染。

（3）避免在操作中说话聊天。也可以戴口罩以防止引起RN A 酶污染。尽量使用一次性的塑料制品，尽量避免共用器具如滤纸、试管等，以防交叉污染。

（4）操作过程中应始终戴一次性橡胶手套，并经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RN A 酶带到试管或污染用具，尽量避免使用一次性塑料手套。

实操三 原料中金黄色葡萄球菌的快速检测

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，简称金葡菌）是引起食源性疾病的主要致病因子，可引起化脓性皮炎和肠毒素肠炎。金黄色葡萄球菌肠毒素是世界性卫生问题，大多数食品及食品原料，如肉、乳、蛋制品，糖果，糕点等，均要求对金黄色葡萄球菌进行检测，我国明确规定食品中金黄色葡萄球菌不得检出。

免疫学方法是金黄色葡萄球菌的传统检测法，因其时间冗长、操作繁琐易导致食品积压，且常出现假阳性或假阴性的结果，依照传统的金黄色葡萄球菌检验方法，从取样至鉴定结果最快需要4d。利用病原微生物中特异性酶而发展起来的选择性显色培养基技术，特异性强、敏感性好，已得到广泛的认可和应用。DNA酶和凝固酶是金黄色葡萄球菌重要的标记酶，目前国内外已有多种显色培养基或测试片产品。

1. 适用范围

本产品适用于各类生、熟食制品，饮料，糕点类，调味品，乳制品等的快速检测。

2. 检测原理

金黄色葡萄球菌测试片（FilmplateTM Staphylococcus aureus BT206）含有选择性培养基和专一性的酶显色剂，运用微生物测试片专有技术，做成一次性快速检验产品，一步培养15～24h 就可确认是否有病原菌的存在，大大地简化了检测程序。

3. 检测方法

（1）样品处理 取样品25mL（g）放入含有225mL灭菌磷酸盐缓冲液或生理盐水的取样罐或均质杯内，制成1:10的样品匀液，调节样品匀液pH至6.0～8.0。用1mL 灭菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，注入含有9mL稀释液的试管内，振摇后成为1:100的样品匀液，以此类推，每次换一支吸管。

（2）接种 一般食品选2～3个稀释度进行检测，将金黄色葡萄球菌测试片（BT206）置于平坦实验台面，揭开上层膜，用无菌吸管吸取1mL 样品匀液慢慢均匀地滴加到纸片上，然后再将上层膜缓慢盖下，静置10s左右，使培养基凝固，每个稀释度接种两片。做一片空白阴性对照。

（3）培养 将测试片叠在一起放回原自封袋中并封口，透明面朝上水平置于恒温培养箱内，堆叠片数不超过12片。培养温度为36℃±1℃，培养15～24h。

4. 结果判读

培养后，测试片上紫红色的菌落为金黄色葡萄球菌；呈蓝色的菌落为其他大肠菌群。出现阳性菌落的样本，最好用其他更为可靠的方法进行验证，没有条件的至少要再取样重复检验一次。

（1）选择菌落数在20～200个之间的纸片进行计数。

（2）若两个稀释度的菌落数均在20～200之间，则取其平均菌落数乘以稀释倍数，即为每毫升（或每克）样品中金黄色葡萄球菌数。

（3）如果所有稀释度的测试片上的菌落数都小于20，则计数稀释度最低的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告之；如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之。

（4）如果所有稀释度的菌落数都大于200，计数最高稀释度的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。计数菌落数大于200的测试片时，也可计数一个或两个具有代表性的方格内的菌落数，换算成单个方格内的菌落数后乘以20（滤纸区面积为20cm²），即为测试片上估算的菌落数。报告单位以 CFU/mL（或 CFU/g）表示。

5. 注意事项

本产品需存放在4～10℃冰箱中，保质期为一年，铝箔袋打开后，未用完的纸片要放回铝箔袋中封好，放到冰箱中，一个月内用完。在高湿度的环境中可能出现冷凝水，最好在拆封前将整包回温至室温。

任务拓展

国家卫计委发布《食品中致病菌限量》问答（2014年3月）。

拓展

复习思考题

1. 简述菌落总数测试片的检测原理。

2. 在酵母和霉菌的速测技术中，快速检验纸片如何计数的？

3. 大肠菌群的速测技术中，其原理、适用范围和检测步骤是什么？