任务引入案例
汕头市食品药品监督管理局2017年4月组织开展了餐饮环节餐具专项监督抽检工作。本次抽样检验共抽检餐具60批次（非集中消毒餐具50批次，集中消毒餐具10批次），合格48批次，不合格12批次，总体合格率80%。12批次不合格餐具中，9批次为非集中消毒餐具，3批次为集中消毒餐具，涉及5家餐饮单位，其中汕头市鲁智笙餐饮有限公司第一分公司、汕头市金平区佳福猪肚小食店、汕头市金平区林记海鲜行、汕头市澄海区澄华南洋火锅城等4家餐饮单位提供的非集中消毒餐具检出不合格，汕头市龙湖区煮饺饮食店提供的“美洁高温消毒餐具”集中消毒餐具检出不合格，不合格项目均为大肠菌群超标。
任务介绍
近年来，一些国家和地区不断发生食品污染事件，特别是随着人民生活水平的提高，对食品的质量和食品的安全性要求越来越高，不仅要求食品能饱肚子，而且要求安全卫生、营养丰富、美味可口，生物检验工作是食品卫生检验的重点，对评价食品卫生质量、保证消费者健康安全有着极为重要的作用。为此，在各种食品生产加工单位均设有化验部门，开展食品微生物检验工作。
菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每1g（每1mL）检样所生长出来的细菌菌落总数。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
大肠菌群，是指一群好氧或兼性厌氧，能发酵乳糖，在乳糖培养基中经37℃、24h培养，产酸产气，革兰氏阴性，无芽孢的杆菌。主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯菌属和肠杆菌属。食品的大肠菌群数是指1mL（或1g）检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最大可能数（MPN）表示。大肠菌群的存在是粪便污染的指标。
任务实操
实操一 冰淇淋菌落总数快速检测法
方法一 纸片法
1. 适用范围
用于各类食品及原料中菌落总数的测定。也可用于与食品接触的容器、操作台和其他设备表面的卫生检测。
2. 方法原理
Petrifilm TM细菌总数测试片（Aerobic count plates）是一种预先制备好的培养基系统，含有标准的培养基、冷水可溶性的凝胶剂和氯化三苯四氮唑（TTC）指示剂，菌落在测试片上呈红色或粉红色，通过计数报告结果。
3. 操作方法
（1）样品处理 无菌量取冰淇淋样品25mL 放入含有225mL 无菌生理盐水的采样瓶或均质杯内，经充分振摇（均质）做成1:10的稀释液。用1mL 灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，注入含有9mL 灭菌生理盐水的试管内，用1mL 灭菌吸管反复吸吹制成1:100的稀释液。以此类推，做出1:1000等稀释度的稀释液，每个稀释度更换一支灭菌吸管。
（2）接种 一般食品选2～3个稀释度进行检测，含菌量少的液体样品（如食用纯水和矿泉水等）可直接用原液检测。将测试片放在水平台面上，揭开上面的透明薄膜，用灭菌吸管吸取样品原液或稀释液1mL，均匀加到中央的纸片上，轻轻将上盖膜放下，静置5min使培养基凝固，最后用手轻轻地压一下。每个稀释度接种两片。
（3）培养 将测试片叠在一起放回原自封袋中，透明面朝上，水平置于恒温培养箱内，堆叠片数不超过12片。培养温度为36℃±1℃，培养15～24h。
4. 结果判断与计数
（1）菌落在纸片上生长后会显示红色斑点，选择菌落数适中（10～100个）的纸片进行计数，乘以稀释倍数后即为每1g（或1mL）样品中所含的细菌菌落总数。菌落数在100以内时，按实有数报告。菌落数大于100时，用2位有效数字，2位有效数字后面的数字，以四舍五入方法计算，并以10的指数来表示。
（2）计数原则与报告方式 通常选择菌落在10～100个的纸片进行计数，乘以稀释倍数报告之（见表3-2中例次1）。国家标准菌落总数报告方式术语为cfu/g或cfu/mL，cfu的含义为菌落形成单位。
若有两个稀释度的菌落数在10～100个，两者的比值小于2，则取其平均数，若大于2，则采用稀释度小者报告（见表3-2中例次2和例次3）。
若三个稀释度的菌落数都在10～100个时，应选择两个低数值的平均数（见表3-2中例次4）。
若三个稀释度的菌落数均小于10个或大于100个时，应重新试用更低或更高的稀释度进行菌落计数；或采用均小于数量标准的最小值，或采用均大于数量标准的最大值（见表3-2中例次5和例次6）。
表3-2 菌落总数检测纸片计数原则与报告方式
5. 注意事项
使用过的纸片上带有活菌，需及时按照生物安全废弃物处理原则进行处理。
方法二 荧光光电快速检测法
传统方法检测产品的菌落总数要经过48h才能出检测结果，会影响产品投放到市场的速度，对于易腐食品，则缩短了产品的货架期；对于原料检验来说，则增加了原料压库的成本，降低了企业的资金周转率。而使用荧光光电快检系统检测产品中的菌落总数，数小时即可得到检测结果，大大节省了检测时间。同时还具有操作简单、节省人工、减少检测环节污染引起的假阳性、自动保存检测结果、提供风险追溯等优势。
1. 适用范围
实时荧光光电快速检测法适用于各类食品及原料中菌落总数的测定。
2. 方法原理(www.xing528.com)
利用实时快速微生物荧光光电检测系统，该系统将最新的荧光光电技术、染色技术、CO2传感技术和特异性的培养技术结合在一起，检测生物体的代谢过程，使之能够同步检测颜色和光子的变化。目标微生物在特定培养基中的生长和代谢可通过感光试剂（色彩和荧光染色）检测。当代谢过程发生时，试剂的光谱模式会发生改变，光传感器检测到这些变化后以预先设定好的时间间隔进行监控并报告检测结果，菌量越高，检测时间越短。
3. 操作方法
（1）样品的处理与制备 取含巧克力与水果成分的乳料冰淇淋1:10稀释后，121℃高压灭菌15min，冷却后备用，编号 AX。取相同冰淇淋25g，与225mL 0.85%生理盐水混合均匀，编号A1。取A15mL，与45mL AX混合均匀，编号A2。将同一批次的巧克力水果口味的冰淇淋进行增菌和冷冻，然后取25g与225mL 0.85%生理盐水混合均匀，编号AZ1。
（2）样品的稀释 取AZ15mL与45mL AX混合均匀，编号AZ2；取AZ25mL，与45mL AX混合均匀，编号AZ3；依此进行6个梯度的10倍稀释。
（3）检测 将上述A1、A2及AZ1～AZ7，各取1mL分别加入1支BioLumix菌落总数检测管中，混合均匀，放入BioLumix 仪器中进行检测，以得到每个样品的BioLumix系统的DT（检测时间）。
同时，将A1、A2及AZ1～AZ7选择合适的稀释度按GB 4789.2—2016做平板培养，以得到每个样品的菌落总数值。
（4）校准曲线的建立和验证 将上述多个样品的BioLumix系统的DT（检测时间）和对应的平板菌落总数值输入到BioLumix 软件界面中，经过修整后，得到一条以DT（检测时间）为横轴，以相应的菌落总数值（CFU/mL）的对数LgCFU 作为纵坐标的校准曲线。
取冰淇淋各25g与225mL 0.85%的生理盐水混合后各取1mL，分别加入BioLu-mix系统菌落总数检测管中上机检测，同时对同一样品按GB 4789.2—2016中的标准做平板培养。将得到DT值带入校准方程中，得到BioLumix系统报出的CFU 值，与对应的平板菌落总数值对比。
4. 结果判定
根据实验数据得到的校准曲线和校准曲线方程以及相关系数，在曲线范围内的菌落总数都可测，同时会自动对超过内控标准上限的高污染样本发出预警。
5. 注意事项
产品的菌含量一般都控制在标准曲线最高限额范围内，否则无法检测到具体的菌落总数。
实操二 饮料中大肠菌群的快速检测
1. 适用范围
大肠菌群纸片法与国标法相对应，将原来几步完成的试验简化为一步，时间由一个星期左右缩短为十几个小时，而且省去了制备培养基和清洗器皿的麻烦，非常适合于生产企业自检和卫生检验部门使用。在计数方面，比传统的MPN 值法更加准确。
2. 使用原理
快检纸片法是以大肠菌群细菌生长发育时分解乳糖产酸，同时产生脱氢酶脱氢，氢与无色氯化三苯四氮唑（TTC）作用形成红色三苯甲臜（TTF）使菌落（菌苔）变红的原理，将一定量的乳糖、指示剂（TTC）、溴甲酚紫、蛋白胨等吸附在特定面积的无菌滤纸上，大肠菌群细菌通过上述两种指示剂显示出发酵乳糖产酸纸片变黄和形成红色斑点（红晕）的固有特性。
3. 检测步骤
（1）样品原液检测 对含菌量少的液体样品可直接用原液检测。将测试片平放在工作台面上，揭开上面的透明薄膜，用灭菌吸管吸取样品原液或稀释液1mL，均匀加到中央的圆圈内，再轻轻将上盖膜放下，静置5min。然后从中间向周围轻轻推刮，使水分在圆圈内均匀分布，并将气泡赶走。
（2）样品稀释液检测 对于含菌量多的样品，则取样品25g（或25mL）放入含有225mL无菌水的玻璃瓶内，充分振摇后成为1:10的稀释液。用1mL 灭菌吸管吸取1:10的稀释液1mL，注入含有9mL无菌水的试管内，振摇后成为1:100的稀释液，以此类推，做出1:1000等稀释度的稀释液。选3个稀释度进行检测。用灭菌吸管吸取稀释液1mL，按样品原液检测方法进行检测。
（3）培养 将加样的测试片放入自封袋中，平放在37℃培养箱内培养15～24h。
4. 结果判定
在测试片培养基上显红色斑点，周围有黄晕并且有气泡者为大肠菌群阳性菌落。如果只做原液，则每个测试片上的阳性菌落数即相当于每毫升大肠菌群数；如同时做三个稀释度，则选择有阳性菌落的最高稀释度的测试片进行计数，然后乘以稀释倍数即为样品中每1g（1L）含有大肠菌群数。
5. 注意事项
如果样品的酸碱度在pH7.0以下时，应先用灭过菌的碱性溶液（如0.01mol/L NaOH）调节到pH7.0～8.0，否则接种后培养基马上变黄。
6. 保存条件
在2～10℃冰箱中，保质期为一年。铝箔袋打开后，未用的测试片要放回袋中重新封好，放到冰箱中，一个月内用完。
任务拓展
检测大肠菌群的食品卫生意义
拓展
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