快速检测蔬菜中的农药残留

任务引入案例

2017年12月28日，原国家食品药品监督管理总局官网陆续发布《总局关于12批次食品不合格情况的通告》（2017年第205号）、（2017年第210号）及（2017年第221号）。其中，广州市白云区广州江南果菜批发市场的6个农残超标批次分别为：鲜菜区127档销售的韭菜，腐霉利检出值为0.86mg/kg，比国家标准规定高出3.3倍；鲜菜区337档销售的茄子，涕灭威检出值为0.267mg/kg，比国家标准规定高出7.9倍；鲜菜区531档销售的韭菜，克百威检出值为0.210mg/kg，比国家标准规定高出9.5倍；鲜菜区219档销售的菠菜，毒死蜱检出值为0.18mg/kg，比国家标准规定高出80.0%；鲜菜3区310档销售的上海青（普通白菜），毒死蜱检出值为0.52mg/kg，比国家标准规定高出4.2倍；而超标最严重的为鲜菜区317档销售的芹菜，毒死蜱检出值为1.8mg/kg，比国家标准规定高出35倍。

从已公布情况看，农残超标的蔬菜一共1940公斤，包括国家“205号”里的韭菜茄子1430公斤和“210号”通告里的菠菜韭菜510公斤，这些蔬菜都全部销售完毕了。对此，白云区食药监局解释，国家食药监总局于9月份开始进行抽检，到白云区食药监局收到不合格检验报告，差不多过了一个月的时间，要找到购买该批次蔬菜的客户非常困难。

收到不合格检验报告后，白云区食药监局要求经营者依法提供进货查验资料，以及追溯生产源头，开展风险控制工作。据悉，白云区食药监局已经对广州江南果菜批发市场经营管理有限公司涉事的6个档口送达了不合格报告并进行了现场检查。经查，因涉事经营者皆履行了食用农产品进货查验等义务，有充分证据证明其对所采购的食用农产品不符合食品安全标准不知情，并能如实说明其进货来源，因此按照规定对经营者免予处罚。

白云区食药监局也分别向天津市武清区市场和质量监督管理局、都匀市市场监督管理局、昆明市呈贡区食品药品监督管理局等发去了关于协查农残超标蔬菜相关情况的函件。

任务介绍

常规的有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的检测手段为气相色谱法，前处理步骤复杂，所需器皿和仪器繁多，不适合现场快速检测。

国标GB/T 5009.199—2003《蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测（速测卡法）》可以实现现场快速筛选，农药速测仪正是基于此原理进行检测。

国标GB/T 5009.145—2003《植物性食品中有机磷和氨基甲酸酯类农药多种残留的测定》分析方法：用水和丙酮振荡或超声提取目标物质，抽滤或离心分离出上清液，取上清液进行液液分配净化，提取液进行旋转蒸发进行浓缩，浓缩液用微型柱再次净化，净化液用旋转蒸发方式再次进行浓缩，浓缩液定容后用气相色谱仪分析。

任务实操

蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速检测。

本标准规定了由酶抑制法测定蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检验方法。

本标准适用于蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速筛选测定。

方法一 速测卡法

1. 方法原理

胆碱酯酶可催化靛酚乙酸酯（红色）水解为乙酸与靛酚（蓝色），有机磷或氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变，由此可判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。

2. 试剂和材料

（1）固化有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的纸片（速测卡）。

（2）pH7.5缓冲溶液 分别取15.0g 磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·12H₂O）与1.59g无水磷酸二氢钾（KH₂PO₄），用500mL蒸馏水溶解。

3. 样品处理

原样处理。

4. 仪器

（1）常量天平。

（2）有条件时配备37℃±2℃恒温装置。

5. 检验步骤

（1）整体测定法

①选取有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成1cm 左右见方碎片，取5g放入带盖瓶中，加入10mL缓冲溶液，振摇50次，静置2min以上。

②取一片速测卡，用白色药片沾取提取液，放置10min以上进行预反应，有条件时在37℃恒温装置中放置10min。预反应后的药片表面必须保持湿润。

③将速测卡对折，用手捏3min 或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片叠合发生反应。

④每批测定应设一个缓冲液的空白对照卡。

（2）表面测定法（粗筛法）

①擦去蔬菜表面泥土，滴2～3滴缓冲溶液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦。

②取一片速测卡，将蔬菜上的液滴滴在白色药片上。

③放置10min以上进行预反应，有条件时在37℃恒温装置中放置10min。预反应后的药片表面必须保持湿润。

④将速测卡对折，用手捏3min 或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片叠合发生反应。

⑤每批测定应设一个缓冲液的空白对照卡。

6. 结果判定

结果以酶被有机磷或氨基甲酸酯类农药抑制（为阳性）、未抑制（为阴性）表示。

与空白对照卡比较，白色药片不变色或略有浅蓝色均为阳性结果。白色药片变为天蓝色或与空白对照卡相同，为阴性结果。

对阳性结果的样品，可用其他分析方法进一步确定具体农药品种和含量。

7. 附则

（1）速测卡技术指标

①灵敏度指标：速测卡对部分农药的检出限见表2-6。

表2-6 部分农药的检出限

②符合率：在检出的30份以上阳性样品中，经气相色谱法验证，阳性结果的符合率应在80%以上。

8. 注意事项

（1）葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，可采取整株（体）蔬菜浸提或采用表面测定法。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株（体）蔬菜浸提的方法，减少色素的干扰。

（2）当温度条件低于37℃，酶反应的速度随之放慢，药片加液后放置反应的时间应相对延长，延长时间的确定，应以空白对照卡用手指（体温）捏3min 时可以变蓝，即可往下操作。注意样品放置的时间应与空白对照卡放置的时间一致才有可比性。空白对照卡不变色的原因：一是药片表面缓冲溶液加的少、预反应后的药片表面不够湿润，二是温度太低。

（3）红色药片与白色药片叠合反应的时间以3min为准，3min后的蓝色会逐渐加深，24h后颜色会逐渐褪去。

方法二 酶抑制率法（分光光度法）

1. 方法原理

在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。正常情况下，酶催化神经传导代谢产物（乙酰胆碱）水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质，用分光光度计在412nm处测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率，通过抑制率可以判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。

2. 试剂

（1）pH8.0缓冲溶液 分别取11.9g 无水磷酸氢二钾与3.2g 磷酸二氢钾，用1000mL蒸馏水溶解。

（2）显色剂 分别取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）和15.6mg 碳酸氢钠，用20mL缓冲溶液溶解，4℃冰箱中保存。

（3）底物 取25.0mg硫代乙酰胆碱，加3.0mL蒸馏水溶解，摇匀后置4℃冰箱中保存备用。保存期不超过两周。

（4）乙酰胆碱酯酶 根据酶的活性情况，用缓冲溶液溶解，3min的吸光度变化ΔA₀值应控制在0.3以上。摇匀后置4℃冰箱中保存备用，保存期不超过4d。

（5）可选用由以上试剂制备的试剂盒。乙酰胆碱酯酶的ΔA₀值应控制在0.3以上。

3. 样品处理(www.xing528.com)

原样处理。

4. 仪器

（1）分光光度计或相应测定仪。

（2）常量天平。

（3）恒温水浴或恒温箱。

5. 检验步骤

（1）样品处理 选取有代表性的蔬菜样品，冲洗掉表面泥土，剪成1cm 左右见方碎片，取样品1g，放入烧杯或提取瓶中，加入5mL缓冲溶液，振荡1～2min，倒出提取液，静置3～5min，待用。

（2）对照溶液测试 先于试管中加入2.5mL 缓冲溶液，再加入0.1mL 酶液、0.1mL显色剂，摇匀后于37℃放置15min以上（每批样品的控制时间应一致）。加入0.1mL底物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入仪器比色池中，记录反应3min的吸光度变化值ΔA₀。

（3）样品溶液测试 先于试管中加入2.5mL 样品提取液，其他操作与对照溶液测试相同，记录反应3min的吸光度变化值ΔA_τ。

6. 结果的表述计算

（1）结果计算如下

抑制率（%）=[（ΔA₀-ΔA_τ）/ΔA₀]×100%

式中 ΔA₀——对照溶液反应3min吸光度的变化值；

ΔA_τ——样品溶液反应3min吸光度的变化值。

（2）结果判定

结果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。

当蔬菜样品提取液对酶的抑制率≥50%时，表示蔬菜中有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药存在，样品为阳性结果。阳性结果的样品需要重复检验2次以上。

对阳性结果的样品，可用其他方法进一步确定具体农药品种和含量。

7. 附则

（1）酶抑制率法技术指标

灵敏度指标：酶抑制率法对部分农药的检出限见表2-7。

表2-7 酶抑制率法对部分农药的检出限

（2）符合率：在检出的抑制率≥50%的30份以上样品中，经气相色谱法验证，阳性结果的符合率应在80%以上。

8. 注意事项

（1）葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，可采取整株（体）蔬菜浸提。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株（体）蔬菜浸提的方法，减少色素的干扰。

（2）当温度条件低于37℃，酶反应的速度随之放慢，加入酶液和显色剂后放置反应的时间应相对延长，延长时间的确定，应以胆碱酯酶空白对照测试3min的吸光度变化ΔA₀值在0.3以上，即可往下操作。注意样品放置时间应与空白对照溶液放置时间一致才有可比性。胆碱酯酶空白对照溶液3min的吸光度变化ΔA₀值＜0.3的原因：一是酶的活性不够，二是温度太低。

方法三 速测仪法

1. 检测原理

利用速测卡中的胆碱酯酶（白色药片）可催化靛酚乙酸酯（红色药片）水解为乙酸与靛酚，由于有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶的活性有抑制作用，使催化水解后的显色发生改变。根据显色的不同，可以判断样品中含有有机磷或氨基甲酸酯类农药的残留情况。

2. 主要仪器参数及特点

测量通道数：10个。

恒温温度：38℃，可选范围：30～50℃。

反应时间：10min，可选范围：0～60min。

显色时间：3min，可选范围：0～60min。

3. 适用范围

主要用于蔬菜、水果、茶叶、粮食、水及土壤中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的检测。适用于农业生产基地、农贸市场、环境保护、质量监督、卫生防疫、宾馆饭店等部门。

4. 样品处理

原样直接进行检测。

5. 检测步骤

（1）装入速测卡 按住开关面板上的“开/关”键约2s，仪器开机，等待提示亮点闪烁消失，预热完成，可以开始测试。

将速测卡插入压条下的各通道底板上，红色药片一端在上方，白色药片一端在下方。

（2）加洗脱液、反应计时

①粗筛法：擦去蔬菜表面泥土，在被测菜叶正面接近叶尖部位滴两滴洗脱液，用另一片菜叶在滴液处轻轻摩擦，将菜叶上洗出的水滴，滴一滴在白色药片上，按“启动”键，反应计时开始（反应时间为10min）。

②整体测定法：对于瓜果或整株类蔬菜样品，擦去表面的泥土，用剪刀或水果刀剪切成1cm 见方的碎片，取5g 放入三角瓶中，加入10mL 萃取液，振摇50次，静置2min后待用。用滴管移取萃取静置后的溶液，滴一滴在白色药片上，按“启动”键，反应计时开始。

（3）加热、显色反应 检查速测卡放置位置是否正确，速测卡中间的虚线应与压条对齐，不要歪斜。仪器发出急促的蜂鸣音（六声）时，关闭上盖将速测卡对折并压住显色开关，仪器开始对速测卡加热、恒温和显色计时。显色时间为3min，显色结束仪器发出缓和的蜂鸣音（三声），同时液晶显示器出现亮点指示“提示”，打开仪器上盖。

（4）结果判定 观察速测卡上白色药片的颜色并与标准色卡进行比对，判断农药残留的强弱，蓝色表示农药为阴性，浅蓝色为弱阳性，白色表示农药为阳性。

6. 结果判定

GB/T 5009.199—2003《蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测》规定，抑制率≥50%时，表示样品中农药超标。

NY/T 448—2001《蔬菜上有机磷和氨基甲酸酯类农药残毒快速检测方法》规定，抑制率≥70%，表示样品中农药超标。

7. 注意事项

（1）葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，可采取整株蔬菜浸提或采用表面测定法。对一些含叶绿素较高的蔬菜，可采用整株蔬菜浸提的方法，减少色素的干扰。

（2）红色药片和白色药片叠合后反应时间以3min为准，3min后的蓝色会逐渐加深，24h后颜色会逐渐褪去。

（3）预反应后的药片表面必须保持湿润。

任务拓展

拓展一 茶叶中农药残留的快速检测

拓展二 GB/T 5009.146—2008《植物性食品中有机氯和拟除虫菊酯类农药多种残留的测定》（节选）

拓展一

拓展二