实验中的材料与方法

1.材料与试剂

样品：采购于恩施市菜市场。

试剂：三羟甲基氨基甲烷、乙酸、乙二胺四乙酸、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、去离子甲酰胺、尿素、过硫酸铵、四甲基乙二胺、乙醇、冰醋酸、甲醛、硝酸银、氢氧化钠、MRS合成培养基：国药集团化学试剂有限公司；D5625-01 DNA提取试剂盒、DNA marker、PCR清洁试剂盒：北京科博汇智生物科技发展有限公司；2xPCR mix：南京诺唯赞生物科技有限公司；rTaq、dNTP mix、pMD18-T vector：大连宝生物技术有限公司；正向引物338F（加入7个核苷酸标签barcodes）和反向引物806R、PCR引物合成和测序：武汉天一辉远生物科技有限公司。

2.仪器与设备

VeritiTM 96-well thermal cycler PCR仪、NanoDrop 2000/2000c：美国Thermo Fisher公司；DCodeTM System：美国Bio Red公司；DYY-12电泳仪：北京六一仪器厂；Miseq PE300高通量测序平台：美国Illumina公司；R920机架式服务器：美国DELL公司；CT15RE冷冻离心机：日本HITACHI公司；Bio-5000 plus扫描仪：上海中晶科技有限公司；Whitley DG250厌氧工作站：英国DWS公司。

3.方 法

（1）样品宏基因组提取与检测

采用试剂盒方法提取腐乳样品中的宏基因组，用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测，测定各样品宏基因组DNA浓度。

（2）PCR-DGGE

将宏基因组DNA浓度调整为一致后作为模板细菌16s rRNA V3区域基因片段PCR扩增。采用25 μL体系进行PCR扩增：10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTP 2 μL，上下游引物各0.5 μL，rTaq 0.5 μL，模板1 μL，灭菌超纯水补充至25 μL。其中上游引物为ALL-GC-V3F（5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGCCCGGGGGCACCGGGGGCCTACGGG AGGCAGCAG-3’），下游引物为ALL-V3R（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’）。扩增程序：95 °C 4 min，95 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 30 s，30个循环，72 °C10 min。扩增结束后，PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。(www.xing528.com)

采用8%的聚丙烯酰胺（丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺＝38.93∶1.07）、变性范围为35%-52%（100%变性剂：尿素42 g，去离子甲酰胺40 mL）的凝胶进行分析。将凝胶置于温度为60 °C的0.5 x TAE电泳缓冲液中，于每个胶孔点样10 μL，先电压120 V，持续80 min，后电压80 V，持续13h。电泳结束后，采用硝酸银法染色，使用扫描仪对电泳图进行观察拍照，找出各泳道优势条带并切胶，将胶块捣碎于50 μL无菌超纯水中，4 °C静置过夜。用不含GC夹的引物（ALL-V3F和ALL-V3R）将回收胶块进行PCR扩增，扩增体系及条件同上。用清洁试剂盒纯化PCR产物，并与载体（PMD18-T）连接后转化到感受态细胞中进行克隆培养，筛选阳性克隆菌液送往武汉天一辉远生物科技有限公司进行测序。使用BioEdit软件将去除载体序列后在NCBI中进行同源性比对。

（3）样品细菌16s rRNA PCR扩增及Miseq高通量测序

参考王玉荣[15]方法进行样品细菌16s rRNA PCR扩增及Miseq高通量测序。采用20 μL扩增体系：5×PCR缓冲液4 μL，dNTP mix 2 μL，上游引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和下游引物806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）各0.8 μL，rTaq酶0.4 μL，模板10 ng，灭菌超纯水补充至20 μL。扩增条件为：95 °C预变性3 min，95 °C变性30 s，55 °C退火30 s，72 °C延伸45 s，共运行30个循环，72 °C延伸10 min。扩增结束后用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，合格后寄至上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序。

（4）序列拼接及质量控制

参照于丹[16]和陈泽斌[17]的方法，在除去不合格序列、barcode序列和引物序列的基础上，将数据序列进行拼接。同时利用PyNAST软件将所有的序列对齐，采用UCLUST算法将相似度＞97%序列划分为一个操作单元（Operational Taxonomic Units，OTU），从而进行物种鉴定和相对含量分析，对腐乳中的微生物多样性进行解析。

（5）腐乳中乳酸菌的分离与鉴定

腐乳样品中乳酸菌的分离采用倍比稀释涂布法。将各样品稀释液涂布于改良MRS固体培养基（含1.5% CaCO3）上，置于37 °C厌氧培养48 h，挑选具有不同特征且透明圈现象明显的菌落划线纯化。纯化后的菌株进行革兰氏染色镜检、过氧化氢试验及冻存。使用参考文献[18]提取各菌株DNA，并参照张晓辉[19]方法使用通用正向引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和反向引物1495R（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’）进行PCR扩增和测序。测序结果分析同（3）。

4.数据处理

通过Origin 8.5软件对DGGE图谱特征条带序列进行统计，同时对样品的稀释曲线（Rarefaction Curve）及香农指数曲线（Shannon Diversity Index Curve）的作图。系统发育树由BioEdit软件和MEGA 5.0软件共同绘制。使用Office 2016绘制平均相对含量＞5%的属水平饼图。Venn图由在线绘图网页（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）进行绘制。相对含量＞1.5%的核心OTU热图由Matlab 2010b绘制。