学术研究中材料与方法的重要性

1.材料与试剂

米酒：采集自湖北省恩施土家族苗族自治州的农户家中，所有样品均为传统自然发酵且处于发酵后期。

三羟甲基氨基甲烷、乙酸、乙二胺四乙酸、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、去离子甲酰胺、尿素、过硫酸铵、四甲基乙二胺、乙醇、冰乙酸、甲醛、硝酸银、氢氧化钠、碳酸钙：国药集团化学试剂有限公司；MRS合成培养基：青岛海博生物技术有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit宏基因组提取试剂盒：德国QIAGEN公司；DNA marker、PCR清洁试剂盒：京科博汇智生物科技发展有限公司；2PCR×mix：南京诺唯赞生物科技有限公司；rTaq、dNTP MIX、pMD18-T：大连宝生物技术有限公司；DGGE扩增用引物ALL-GC-V3F/ALL-V3R、正向含有7个核苷酸标签（barcode）的MiSeq测序用引物338F/806R、乳酸菌鉴定用引物27F/1495R、鉴定阳性克隆用引物M13F（-47）/M13R（-48）：武汉天一辉远生物科技有限公司合成。

2.仪器与设备

Veriti PCR扩增仪：美国AB公司；NanoDrop 2000微量紫外分光光度计：美国NanoDrop公司；DCodeTM System：美国Bio-Rad公司；DYY-12电泳仪：北京六一仪器厂；MiSeq PE300高通量测序平台：美国Illumina公司；R920机架式服务器：美国DELL公司；CT15RE冷冻离心机：日本HITACHI公司；Bio-5000 plus扫描仪：上海中晶科技有限公司；DG250厌氧工作站：英国DWS公司；ECLIPSE Ci生物显微镜：日本NIKON公司。

3.方 法

（1）米酒中微生物宏基因组DNA提取

参照QIAGEN DNeasy mericon Food Kit试剂盒使用说明提取10个米酒样品中微生物的宏基因组DNA，使用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，并使用NanoDrop检测其浓度。

（2）PCR扩增米酒样品细菌16s rRNA基因片段

将各样品宏基因组DNA浓度做适当稀释并确定浓度一致，使用带有GC夹的正向引物ALL-GC-V3F（5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGC CCG GGG GCA CCG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’）和反向引物ALL-V3R（5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’）对样品DNA的V3区域进行16s rRNA PCR扩增。扩增体系为25 μL：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP mix 2 μL，ALL-GC-V3F 0.5 μL，ALL-V3R 0.5 μL，DNA模板量 2 μL，rTaq酶 0.5 μL，ddH2O 17 μL。反应条件为95 °C 预变性4 min，95 °C 变性30 s，55 °C 退火30 s，72 °C延伸30 s，30个循环，72 °C完全延伸 10 min。PCR扩增结束后，用2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

（3）DGGE分析

将上述检测合格PCR扩增产物作为模板进行DGGE凝胶电泳。使用8%聚丙烯胺胶，上层胶为0%变性剂，下层胶为35%～65%梯度变性剂。电泳条件：温度为60 °C，电泳缓冲液为0.5 TAE，点样量为10 μL，先120 V，78 min，使PCR扩增产物快速通过上层胶，后80 V，13 h。

（4）DGGE优势条带分析

电泳结束后对凝胶进行硝酸银染色，找出特异性条带并进行回收、扩增、清洁、连接、转化和克隆鉴定，筛选出阳性克隆子送往武汉天一辉远生物有限公司进行测序。测序结果使用Bio Edit软件将序列进行拼接，并在NCBI Blast中比对查询。(www.xing528.com)

（5）米酒中细菌16s rRNA PCR扩增和MiSeq高通量测序

参照沈馨[20]方法，将（1）中样品总DNA作为模板进行16s rRNA PCR扩增。扩增体系：5×PCR Buffer 4 μL，dNTP Mix 2 μL，338F和806R各0.5 μL，rTaq酶0.4 μL，DNA模板 10 ng，ddH2O 12.6 μL。其中引物序列为338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）/806R（5’-GGACTACHVGGGT-3’）。扩增反应条件为：95 °C 预变性3 min；95 °C变性30 s，55 °C退火30 s，72 °C延伸45 s，循环30次，72 °C完全延伸10 min。其扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，送至上海美吉生物医药科技有限公司进行MiSeq测序。

（6）序列拼接和质量控制

参照王玉荣[21]方法，对MiSeq高通量下机序列进行拼接和质量控制。首先去除不合格序列，包括碱基数＜50 bp、碱基错配比率＞0.2、barcode存在碱基错配和引物错配碱基数＞2 bp的序列，其次去除barcode和引物序列，将剩余序列合并为一个文件以完成后续分析。

（7）生物信息学分析

参照王玉荣方法[22]，使用QIIME分析平台对序列进行生物信息学分析。在将各序列校准对齐后，使用UCLUST两步法归并建立操作分类单元（Operation Taxonomic Unit，OTU）。选出代表性序列在Greengenes数据库中进行同源性比对，确定各OTU的种属地位，同时利用Chao 1指数和Shannon 指数评价微生物菌群的丰度和多样性。

（8）米酒中乳酸菌的分离与纯化

使用倍比稀释涂布的方法，将各样品稀释液均匀地涂布于MRS（含1.2%～1.5%CaCO3）固体培养基上，置于DG250厌氧工作站中（85%N2，5%CO2及10%H2），37 °C培养48 h。挑选具有透明圈且形状大小不一的特征菌落进行划线纯化2～3次，将革兰氏染色为阳性且过氧化氢酶试验为阴性的菌落进行保存。

（9）米酒中乳酸菌的鉴定

提取各纯化菌株DNA，参考张晓辉[23]中的方法使用通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1495R（5’-CTACGGCTACC TTGTTACGA-3’）进行PCR扩增。将扩增产物进行检测、清洁、连接、转化和克隆鉴定，筛选出阳性克隆子送往武汉天一辉远生物有限公司进行测序。测序结果使用Bio Edit软件将序列进行拼接，并在NCBI Blast中比对查询。

4.数据分析

使用Bio Edit软件和MEGA 5.0软件采用比邻法构建系统发育树，使用Origin 8.5软件对MiSeq高通量测序结果中优势门相对含量、优势属相对含量和OTU出现次数进行绘图。使用Matlab 2010b软件绘制核心OTU相对含量的热图。