高通量测序技术具有通量高、检测速度快等优点，可更加准确、真实地反映样本中微生物群落结构的组成。因此，首先使用MiSeq高通量测序技术对样品中细菌在门、纲、目、科和属各水平上的分类数量进行统计，然后利用超1指数和香农指数对其物种丰度和多样性进行分析，结果如表3-4所示。
由表3-4可知，样品MGC01、MGC02和MGC03经质控合格后的序列分别为25 534条、27 773条和36 858条，在97%的相似度下划分的OTU数分别为3 545个、2 528个和4 689个。当测序量为23 610条时，样品MGC01、MGC02和MGC03的超1指数分别为1 860、1 613和2 362，香农指数分别为7.02、5.79和7.73，其中MGC03的超1指数和香农指数值均最大，因而样品MGC03中细菌丰度和多样性均高于MGC01和MGC02。进一步对测序深度是否能捕获细菌多样性信息进行了分析，结果如图3-6所示。
表3-4 样品测序结果及各分类地位数量
注：超1指数和香农指数均在测序量为23 610条序列时计算所得。
图3-6 稀疏曲线（A）和香农指数曲线（B）
由图3-6可知，当序列数达到30 000条时，稀疏曲线随序列数的增加而增加，而香农指数曲线在＞10 000条序列时就已经进入平台期，说明随着测序深度的增加可能还会有新的物种被发现但样品中微生物多样性不会再增加。由此可见，本研究的测序深度是足以满足后续数据分析要求的。本研究进一步对各样品特有及样品间共有OTU数及序列数进行了分析，结果如图3-7所示。
图3-7 各样品OTU数及序列数Veen图(www.xing528.com)
由图3-7可知，样品MGC01、MGC02和MGC03中特有的OTU分别为2 442个、1 464个和3 565个，所包含序列数分别为3 982条、2 305条和9 698条。样品MGC01和MGC02共有OTU数为294个，样品MGC02和MGC03共有OTU数为315个，样品MGC01和MGC03共有OTU数为354个；3个梅干菜样品共有OTU数为455个，其所包含的序列为61 568条，占总序列数的68.28%。由此可见，恩施地区梅干菜样品中含有丰富的细菌物种且各样品间存在大量共有细菌菌群。
样品MGC01、MGC02和MGC03中所含细菌门的数量分别为13个、9个和10个，包含细菌属的数量分别为186个、149个和148个，本研究将相对丰度＞1.0%的细菌门和属定义为优势细菌门和属，并对其平均相对含量进行分析，结果如图3-8所示。
由图3-8可知，恩施地区产梅干菜样品中的优势细菌门分别为硬壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、蓝细菌门（Cyanobacteria）和放线菌门（Actinobacteria），其平均相对含量分别为60.70%、23.28%、11.16%、2.76%；优势细菌属主要为乳酸杆菌属（Lactobacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、葡萄球菌（Staphylococcus）、魏斯氏菌属（Weissella）、鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter）、四联球菌属（Tetragenococcus）和棒状杆菌属（Corynebacterium），其平均相对含量分别为60.50%、8.69%、2.86%、1.73%、1.28%、1.07%、1.03%和1.00%。值得一提的是，仍有7.40%的序列不能鉴定到属水平，这进一步说明恩施地区梅干菜样品中细菌多样性较高。
图3-8 梅干菜样品中优势细菌门（A）和属（B）相对含量分析
2.梅干菜中乳酸菌菌株的分离鉴定
在使用高通量测序技术解析发现梅干菜中的细菌主要以乳酸菌为主的基础上，本研究进一步采用传统微生物学手段从3个梅干菜样品中分离得到12株疑似乳酸菌，编号分别为MGC01-1、MGC01-2、MGC01-3、MGC01-4、MGC02-1、MGC02-2、MGC02-3、MGC02-4、MGC03-1、MGC03-2、MGC03-3和MGC03-4，疑似乳酸菌与其近源种模式株的系统发育树如图3-9所示。
由图3-9可知，菌株MGC03-3、MGC01-3、MGC01-4、MGC02-1、MGC02-2、MGC02-3和MGC02-4与L.plantarum NBRC 15891在同一个进化分枝中，亲缘关系较近，故将其判定为植物乳杆菌（L.plantarum），同理，将菌株MGC03-1鉴定为副干酪乳杆菌副干酪亚种（L.paracasei subsp.paracasei），菌株MGC01-1鉴定为融合魏斯氏菌（W.confusa），菌株MGC03-2鉴定为食品乳杆菌（L.alimentarius），菌株MGC01-2和MGC03-4鉴定为短乳杆菌（L.brevis）。
图3-9 梅干菜中乳酸菌系统发育树
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