深入分析结果与解读

1.细菌多样性分析

（1）序列丰富度分析

采用MiSeq高通量测序技术分析细菌多样性时在100%相似度下共测得42 954条序列，平均每个样品14 318条序列；在97%的相似度下又可将这些序列划分成4 347个OTU，对平均相对含量＞0.1%的OTU进行分析，结果如图3-1所示。

图3-1　核心OTUs相对含量分析

由图3-1可知，平均相对含量＞0.1%的OTU有36个，其中OTU1168、OTU1427和OTU4213的平均相对含量明显高于其他OTU，且这3个OTU在腌菜样品YC01中的相对含量分别为71.16%、7.55%和0.33%；在腌菜样品YC02中的相对含量分别依次为68.40%、0和2.20%；在腌菜样品YC03中的相对含量分别为53.19%、0.08%和1.46%。将OTU1168的代表性序列分别在Greengenes和RDP数据库进行比对，均将该序列鉴定为乳酸杆菌属（Lactobacillus）。由此可见，恩施地区腌菜样品中存在大量共有细菌菌群，且乳酸杆菌可能为其优势细菌属。

（2）α多样性分析

在测序深度为28 910条序列的条件下，对腌菜样品YC01、YC02和YC03进行α多样性分析。YC01、YC02和YC03的超1（Chao1）指数分别为700、837和983，香农（Shannon）指数分别为2.98、2.42和4.34，由此可见，YC03中的细菌丰富度和多样性要高于YC01和YC02。

（3）优势菌相对含量分析

经比对发现，3个腌菜样品中共检测到了10个门、24个纲、43个目、72个科和120个属的细菌，所有样品仅有2.68%的序列不能鉴定到属水平。将平均相对含量＞0.1%的细菌门定义为优势菌门，优势菌门在各样品中的分布情况如图3-2所示。

图3-2　优势细菌门相对含量分析

由图3-2可知，腌菜样品中优势细菌门为硬壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria）。所有腌菜样品中含量最高的均为Firmicutes，其平均相对含量高达97.09%；其次为Proteobacteria，平均相对含量为2.02%。腌菜样品YC01、YC02和YC03中鉴定出的细菌属数量分别为54个、95个和73个，各样品优势细菌属的相对含量如图3-3所示。

图3-3　优势细菌属相对含量分析

由图3-3可知，平均相对含量＞0.1%的优势细菌属有7个，即乳酸杆菌属（Lactobacillus）、魏斯氏菌属（Weissella）、明串珠菌属（Leuconostoc）、弧菌属（Vibrio）、假单胞菌属（Pseudomonas）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter）和黄杆菌属（Flavobacterium），其平均相对含量分别为82.37%、7.02%、5.38%、0.58%、0.27%、0.15%和0.14%。王一淇等[21]通过采用纯培养计数的方法对湖南芥菜腌制发酵过程中的菌相变化规律进行了解析，结果表明乳酸杆菌属（Lactobacillus）在芥菜自然发酵的中期和后期都占主要优势，这与本研究结果有相似之处。(www.xing528.com)

2.乳酸菌指纹图谱分析

经高通量测序分析发现Lactobacillus在样品中的平均相对含量高达82.37%，是恩施腌菜样品中平均相对含量最高的细菌属，本研究进一步采用DGGE指纹图谱技术对样品中Lactobacillus的种类及其在各样品间的差异进行研究，结果如图3-4所示。

图3-4　乳酸菌DGGE指纹图谱

由图3-4可知，在DGGE指纹图谱上每个样品都检测出数目不等的条带。其中条带LYC3和LYC4为腌菜样品中共有条带，而条带LYC1为腌菜样品YC03中特有条带，条带LYC5为腌菜样品YC01中特有条带，条带LYC2为腌菜样品YC01和YC03共有条带，这说明恩施腌菜中含有多种共有乳酸杆菌，同时各样品中也含有特有细菌菌群。腌菜样品YC03泳道中的条带数量及条带明亮度高于腌菜样品YC01和YC02泳道，说明腌菜样品YC03中的乳酸菌的丰度较腌菜样品YC01和YC02中的高，这与高通量测序结果一致。将回收的条带与NCBI中的模式株比对，结果如表3-1所示。

表3-1　乳酸菌PCR-DGGE优势条带比对结果

由表3-1所知，回收的优势条带中有4条隶属于乳酸杆菌属，其中LYC1为清酒乳杆菌（L.sakei），LYC2为L.insicii，LYC3为L.plantarum subsp.argentoratensis，LYC4为植物乳杆菌植物亚种（L.plantarum subsp.plantarum），LYC5为耐酸乳杆菌（L.acetotolerans）。

3.乳酸菌的分离鉴定

通过稀释涂布平板法从3个腌菜样品中分离出15株菌，编号分别为YC01-1、YC01-2、YC01-3、YC01-4、YC02-1、YC02-2、YC02-3、YC02-4、YC02-5、YC03-1、YC03-2、YC03-3、YC03-4、YC03-5和YC03-6，经生理生化试验得出15株菌株革兰氏染色为阳性、过氧化氢酶试验检测为阴性，16s rRNA鉴定序列与最似模式菌菌株的相似度均在99%以上。乳酸菌菌株与模式株的进化关系如图3-5所示。

图3-5　乳酸菌菌株基于16s rRNA序列构建的系统进化树

由图3-5可知，经鉴定及比对发现这些菌株主要为植物乳杆菌（L.plantarum）、短乳杆菌（L.brevi）、弯曲乳杆菌（L.curvatus）、食品乳杆菌（L.alimentarius）和清酒乳杆菌（L.sakei）。进一步对各菌株在样品中的分布进行统计，结果如表3-2所示。

表3-2　各样品中乳酸菌菌株分布情况

由表3-2可知，从腌菜样品YC01共分离出4株乳酸菌，经鉴定分别为L.plantarum、L.curvatus和L.brevi；从腌菜样品YC02中共分离出5株乳酸菌，经鉴定分别为L.plantarum和L.sakei；从腌菜样品YC03中分离出6株乳酸菌，经鉴定分别为L.plantarum和L.alimentarius。由此可见，虽然Lactobacillus为腌菜样品中的优势菌，但乳酸杆菌的构成在样品间存在一定的差异。值得一提的是，腌菜样品YC02中的5株乳杆菌中有4株为L.sakei，有研究表明该菌能产生多种细菌素，其中Ⅰ类、部分Ⅱa和Ⅱb类清酒乳杆菌细菌素均具有一定的抑菌作用[22]，这可能是导致腌菜样品YC02中细菌丰度低于其他样品的原因之一。此外，采用传统微生物学手段从样品中分离出15株隶属于5个种的乳酸菌，但未分离出DGGE检测到的L.insicii和L.acetotolerans，这可能与微生物特殊生长需求以及培养条件的限制有关。