材料与方法详解

1.材料与试剂

腌菜样品：采自恩施舞阳坝菜市场，3份，编号分别为YC01、YC02和YC03，每份分装两管。

聚丙烯酰胺、尿素、N,N-亚甲基二丙烯酰胺、四甲基乙二胺、过硫酸铵、乙醇、冰醋酸、甲醛、硝酸银、碳酸钙、丙三醇、过氧化氢、三氯甲烷、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠、乙酸钙、十二烷基硫酸钠、酚、氯仿、异戊醇、醋酸钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；Axygen清洁试剂盒：北京科博汇智生物科技发展有限公司；溶菌酶（400 U/μg）、蛋白酶K（20 U/μg）、dNTP mix、10×聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）Buffer、rTaq酶（5 U/μL）、pMD18-T vector和Solution I：宝生物工程（大连）有限公司；10×Loading buffer、DL2000脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker：宝日医生物技术（北京）有限公司；2×PCR mix：南京诺唯赞生物科技有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit提取试剂盒：德国QIAGEN公司。

MRS培养基：青岛海博生物技术有限公司。

高通量测序引物：正向引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）；反向引物806R（5’-GGACTACHVGGGT-3’）。

带有GC夹子的PCR-DGGE正向引物Lac-GC-V3F（5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGCCCGGGGGCACCGGGGGACT CCTACGGGAGGCAGCAGT-3’），不带GC夹子的PCR-DGGE正向引物Lac-V3F（5’-ACCGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3’）和PCR-DGGE反向引物Lac-V3R（5’-GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’）。

乳酸菌PCR扩增引物：正向引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）；反向引物1495R（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’）。

验证阳性克隆引物：正向引物M13F（5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCA CGAC-3’）和；反向引物M13R（5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’）。

以上引物均由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。

2.仪器与设备

VeritiTM96孔梯度PCR扩增仪：美国AB公司；ND-2000C微量紫外分光光度计：美国Nano Drop公司；DYY-12水平电泳仪：北京市六一仪器厂；DCodeTM System、UV PCDS8000凝胶成像分析系统：美国BIO-RED公司；Bio-5000 plus扫描仪：上海中晶科技有限公司；DG250厌氧工作站：英国DWS公司；5810R台式高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；ECLIPSE Ci生物显微镜：日本Nikon公司。

3.方 法

（1）基因组DNA提取(www.xing528.com)

使用DNA提取试剂盒，按照试剂盒使用说明提取样品基因组DNA，然后用微量紫外分光光度计检测其浓度和纯度。

（2）细菌多样性分析

PCR扩增及测序：16s rRNA V3～V4区。PCR扩增体系为5×FastPfu Buffer 4.0 μL，2.5mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）mix 2.0 μL，5 μmol/L的正（338F）反（806R）引物各0.8 μL，rTaq酶0.4 μL，DNA模板10 ng，双蒸水（ddH2O）补齐至20 μL。PCR扩增程序为95 °C预变性3 min；95 °C变性30 s，55 °C退火30 s，72 °C延伸45 s，30次循环；72 °C再延伸10 min[13]。扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测合格后寄至上海美吉生物医药科技有限公司进行MiSeq高通量测序。

序列质量控制：参照文献[14]中的方法对下机后的序列进行拼接和质量控制，对合格的序列进行下一步分析。

序列分析：参照CAPORASO J G等[15-16]的方法使用QIIME数据分析平台对质控后的序列分别以100%和97%的相似度进行序列划分，从每个操作分类单元（Operational Taxonomic Units，OTU）中选择一条代表性序列与Greengenes和RDP数据库进行比对，统计各分类水平信息。

（3）乳酸菌指纹图谱分析

PCR扩增：将各样品基因组DNA浓度稀释至20 ng/μL。PCR扩增条件为10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTP mix（2.5 mmol/L）2.0 μL，LacF-GC-V3F（10 μmol/L）和Lac-V3R（10 μmol/L）各0.5 μL，rTaq酶0.2 μL，DNA模板0.5 μL，用ddH2O将体系补齐至25 μL[17]。PCR扩增程序为94 °C预变性5 min；94 °C变性30 s，55 °C退火1 min，72 °C延伸90 s，30个循环；72 °C再延伸10 min[18]。用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增出目的条带。

DGGE检测：聚丙烯酰胺凝胶变性剂变性范围为35%～52%，上样量为10 μL，待0.5×三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸（tris base-acetic acid-ethylene diamine tetra acetic acid，TAE）制成的缓冲溶液温度升至60 °C时，调节电压120 V运行78 min，然后80 V维持13 h。电泳结束后，待缓冲溶液冷却至室温采用银染法使凝胶显色。

条带回收测序：将显色后的凝胶置于扫描仪上扫描成像，标记特征条带并用手术刀切下分别置于无菌EP管中，添加50 μL无菌超纯水，4 °C静置过夜，然后进行PCR扩增，PCR扩增条件为2×PCR mix 12.5 μL，引物Lac-V3F和Lac-V3R各0.5 μL，DNA模板2.0 μL，无菌超纯水补齐至25 μL。PCR扩增程序及检测方法同上。参照樊哲新等[19]的方法对合格的PCR产物进行清洁、连接pMD18-T载体、转化大肠杆菌（Escherichia coli）Top10以及鉴定阳性克隆。将阳性克隆寄至武汉天一辉远生物科技有限公司进行测序。将测回的序列用DNAMAN软件处理后置于美国国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）上进行比对，选取同源性较高的菌株，利用MEGA软件中的邻近法（Neighbor Joining，NJ）构建系统发育树。

（4）乳酸菌的分离鉴定

分离：采用稀释涂布平板法分别将3个样品稀释至10－6和10－7梯度，然后取100 μL稀释液涂布于含1.0% CaCO3的MRS琼脂培养基上，置于厌氧工作站中，37 °C培养48 h后，挑选周围有透明圈的单菌落纯化2～3代，镜检合格后甘油保藏。

鉴定：对分离出的菌株进行革兰氏染色以及过氧化氢酶试验；参照文献[20]中的方法提取乳酸菌DNA，然后以提取的DNA为模板进行PCR扩增，扩增条件和程序以及鉴定方法同（3）。